ואן ניסטלרוי עסק בבית הספר בספורט: טניס והתעמלות אמנותית, ושיחק בקבוצת הכדורגל המקומית בעיר הולדתו כבלם אחורי. קריירת הכדורגל המקצועית של ואן ניסטלרוי התחילה ב-1993, כשעבר לשחק בקבוצת דן בוס.
אחרי ארבע שנות ניסיון, התקדם ואן ניסטלרוי ועבר לקבוצת הירנביין מהליגה הראשונה בהולנד, שם שיפר את יכולותיו כחלוץ. על מנת לשפר את רמת המשחק שלו, המליץ לו מאמנו החדש לראות את דניס ברגקאמפ משחק. בעקבות ההמלצה, נהג ואן ניסטלרוי לנסוע כ-200 קילומטר לבדו, כדי לצפות במשחקים בהם השתתף ברגקאמפ, וממנו הוא למד הרבה. את השיפור ביכולותיו ניתן לראות מכך, שאת עונתו הראשונה בהירנביין סיים עם 13 שערים ב-30 הופעות.
ביום הולדתו ה-22, חתם ואן ניסטלרוי בפ.ס.וו. איינדהובן תמורת 4.2 מיליון ליש"ט, שיא בהעברות בין קבוצות הולנדיות. הוא החזיר את ההשקעה במהירות, כשהבקיע לראשונה בקבוצה נגד קבוצתו לשעבר כבר באוגוסט. עד סוף אוקטובר, ואן ניסטלרוי המשיך להרשים כשהבקיע שלושער במשחק של קבוצתו נגד ספרטה רוטרדם. ב-18 בנובמבר1998, שותף לראשונה במשחק הנבחרת ההולנדית בתיקו 1-1 נגד גרמניה.
את העונה הראשונה שלו בהירנביין, במאי1999, הוא סיים כמלך השערים של הליגה ההולנדית, לאחר שהבקיע 31 שערים, זכה בתואר שחקן העונה בהולנד והגיע למקום השני בתואר כדור הזהב.
בעונה הבאה עבר ואן ניסטלרוי לקבוצת פ.ס.וו. איינדהובן, בה השיג שיא הבקעות של 60 שערים בשתי עונות, ובשתיהן נבחר לכדורגלן השנה בהולנד. בעונת 1999/2000 כבש פעמיים שלושער מול אייאקס אמסטרדם.
במרץ2001, לאחר שהחלים מהפציעה, חזר לשחק וכבר במשחק הראשון שלו הבקיע צמד עבור קבוצתו. באותה תקופה החל לעורר את התעניינותם של מועדוני כדורגל גדולים באירופה, ולאחר שדחה הצעת רכישה מריאל מדריד, עבר ואן ניסטלרוי למנצ'סטר יונייטד ב-23 באפריל 2001, תוך שבירת שיא בריטי בסכום ההעברות: 19 מיליון ליש"ט.
כדאיות ההשקעה לא הוטלה בספק כבר בעונתו הראשונה במדי השדים האדומים. הוא הבקיע במשחקו הראשון, בהפסד לליברפול במגן הקהילה, ומאז הבקיע שערים רבים: בעונתו הראשונה במנצ'סטר הבקיע 36 גולים. הישג זה מרשים במיוחד, לאור הפציעה שממנה סבל לפני כן ושאיימה לסיים לו את הקריירה.
בעונת 2002/03, עונתו השנייה במועדון, הבקיע ואן ניסטלרוי 44 שערים והגשים את שאיפתו לזכות באליפות הפרמייר ליג. בנוסף, כבש פעמיים בשני משחקים מול ריאל מדריד במסגרת רבע גמר ליגת האלופות באותה שנה, אך לא הצליח להעפיל לשלב חצי הגמר.
בעונתו השלישית במנצ'סטר, הראה יכולת חלשה יותר, אך עם זאת הבקיע 30 שערים עבור היונייטד. ב-7 בפברואר2004 הבקיע את שעריו ה-100 ו-101 במספר במדי מנצ'סטר יונייטד, בצמד שכבש מול אברטון בניצחון 3–4 בגודיסון פארק.
בעונת 2006/07 עבר ואן ניסטלרוי לשחק בריאל מדריד והוביל את קבוצתו לזכייה באליפות דרמטית. הוא סיים את עונתו הראשונה בקבוצה כמלך השערים של הליגה הספרדית עם 25 שערים בליגה ושערים נוספים בליגת האלופות. בעונה הבאה עזר לקבוצה לזכות באליפות נוספת עם 16 כיבושים. הוא החל היטב את עונת 2008/09 - כבש ארבעה שערים בשישה משחקים - אך נפצע בנובמבר 2008 ולא שותף בשאר משחקי העונה.
ב-23 בינואר2010 עבר ואן ניסטלרוי לקבוצת המבורג הגרמנית,[1] וערך את הופעת הבכורה שלו בקבוצה ב-6 בפברואר מול פ.צ. קלן. את שער הבכורה שלו בקבוצה, כבש ואן ניסטלרוי ב-13 בפברואר מול קבוצת שטוטגרט כאשר רשם לזכותו הבקעת צמד. במהלך שהותו בגרמניה, קרע ואן ניסטלרוי את הרצועה בברך והיה חשש כי סיים את הקריירה.[2]
ב-2014 הוכרז כי ואן ניסטלרוי יהיה עוזרו של חוס הידינק כמאמן הנבחרת.[7]
קריירת אימון
לאחר שאימן את קבוצות הנוער של פ.ס. וו. איינדהובן, במרץ 2014, הוכרז כי ואן ניסטלרוי יהיה עוזר מאמן נבחרת הולנד לאחר מונדיאל 2014.
ב-25 ביוני 2018 ואן ניסטלרוי מונה למאמן פ.ס. וו. איינדהובן עד גיל 19. בדצמבר 2019 אושר כי ואן ניסטלרוי, לצד תפקידו בפ.ס.וו, ישמש כעוזר מאמן נבחרת הולנד לקראת יורו 2020.
לקראת עונת 2022/2023 מונה ואן ניסטלרוי למאמן פ.ס. וו. איינדהובן כמחליפו של רוג'ר שמידט שעזב את תפקידו. הוא חתם על חוזה לשלוש שנים.[8] כבר במשחקו הראשון בקבוצה זכה עמה בתואר מגן יוהאם קרויף, לאחר ניצחון 3-5 על אייאקס.
ב-24 במאי 2023 הודיע על התפטרותו מתפקיד המאמן.
ביולי 2024 חזר ואן ניסטלרוי למנצ'סטר יונייטד בתפקיד עוזרו של המאמן אריק טן האך.
ב-28 באוקטובר 2024 לאחר פיטוריו של אריק טן האך מתפקיד מאמן מנצ'סטר יונייטד מונה ואן ניסטלרוי למאמנה הזמני של הקבוצה, והדריך אותה בארבעה משחקים. עם מינוי המאמן הקבוע החדש, רובן אמורים, שהגיע עם צוות מקצועי משלו, הוחלט כי ואן ניסטלרוי יעזוב את המועדון.
ב-29 בנובמבר 2024 מונה ואן ניסטלרוי למאמנה של לסטר.