Après la mort de son mari en 1621 à l'âge de 30 ans, elle se dédie avec sa belle-mère Christine de Lorraine à l'éducation de ses huit enfants, en particulier de son fils, futur grand-duc Ferdinand II de Médicis. Selon les dispositions testamentaires de Cosme II, leur fils Ferdinand est placé sous la tutelle de Marie-Madeleine et de sa belle-mère Christine, épaulées par un conseil formé de quatre conseillers.
Marie-Madeleine est considérée comme bigote et dispendieuse[3]. Ses dons excessifs aux couvents et monastères ont des conséquences catastrophiques sur les finances de l’État. De plus, tandis que Marie-Madeleine règne dans un esprit pro-autrichien, sa corégente Christine de Lorraine pratique une politique amicale envers la France. Après la victoire du camp catholique dans la bataille de la Montagne-Blanche, à laquelle ont pris part des troupes toscanes, elle fait apposer sur la façade de la Villa di Poggio Imperiale des écussons des Habsbourg, et fait peindre à l'intérieur des cycles de fresques du peintre Matteo Rosselli symbolisant la victoire de la « piété autrichienne » sur les « hérétiques et rebelles ».
Elle a en héritage le gouvernement de la ville de San Miniato jusqu'à sa mort et elle s'emploie à la faire devenir diocèse. D'une grande piété, elle est proche de sa belle-fille Vittoria della Rovere.
La grande-duchesse meurt à 42 ans, après une visite à son frère Léopold à Innsbruck sur le chemin du retour à Passau, en Allemagne. Elle est enterrée dans la Basilique San Lorenzo de Florence. Son fils est au pouvoir depuis un an.
↑Mina Gregori (trad. de l'italien), Le musée des Offices et le Palais Pitti : La peinture à Florence, Paris, Éd. Place des Victoires, , 685 p. (ISBN2-84459-006-3, SUDOC046924620), p. 333
↑Anne-Marie Bonnet et Barbara Maria Schellewald, Frauen in der Frühen Neuzeit : Lebensentwürfe in Kunst und Literatur, Böhlau Verlag Köln Weimar, , 264 p. (ISBN978-3-412-10304-0), p. 235.
Les générations sont numérotées dans l'ordre de la descendance depuis les premiers archiducs. Au sein de chaque génération, l'ordre est strictement chronologique et défini par la date de naissance.