James Maitland Stewart nasceu em 20 de maio de 1908, no distrito de Indiana, Pensilvânia, primogênito de Elizabeth Ruth Jackson (1875-1953) e Alexander Maitland Stewart (1871-1961), donos de de uma loja de ferragens. Jimmy, como fora apelidado, tinha ascendência irlandesa e escocesa, sendo descendente de veteranos da Revolução Americana, Guerra da Secessão e da Guerra de 1812. Além disso, foi criado como presbiteriano.
O mais velho de três filhos, se esperava que o futuro astro de Hollywood continuasse os negócios da família, como aconteceu por três gerações. Sua mãe, segundo biógrafos, era uma excelente pianista, embora seu pai tenha recusado pedidos do filho para que a mãe lhe desse aulas de piano. Ainda assim, tempos depois, Stewart aprendeu a tocar acordeão, instrumento dado de presente por seu pai e que logo se tornaria um conhecido passatempo do ator fora dos palcos e gravações.
Stewart cresceu como uma criança tímida e passava a maior parte de seu tempo pós-escola no porão, a trabalhar em modelos de aeronaves, tendo sonho de seguir carreira na aviação, algo reforçado pelo lendário voo de Charles Lindbergh, em 1927.
Stewart estudou na escola preparatória Mercersburg Academy, graduando-se em 1928. Ali, fez parte dos times de corrida e futebol americano. Além disso, foi editor de arte do anuário escolar e fez parte do coral estudantil. Durante sua primeira férias de Verão, Jimmy voltou à cidade natal para trabalhar como carregador de tijolos para uma empresa de construção local. Aceitou, da mesma forma, trabalhos em rodovias, onde pintava linhas de estradas. Ao longo de dois verões seguintes, conseguiu emprego como assistente de um mágico profissional. Fez sua primeira aparição como ator no palco de Mercersburg, contracenando a peça The Wolfs.
No entanto, Jimmy viria a abandonar os planos de pilotagem após pedidos de seu pai. Assim, matriculou-se na Universidade de Princeton, em 1928. Destacou-se no estudo da arquitetura, sendo logo premiado com uma bolsa de estudos de pós-graduação. Na universidade, interessou-se bastante pelas artes, como música e teatro. Foi convidado para a University Players, uma companhia intercolegial de verão, localizada em Cabo Cod. Fez, então, pequenos papéis na companhia, após formar-se em 1932. Na University Players, conheceu Margaret Sullavan e Henry Fonda, também artistas. James e Henry, inclusive, tornaram-se amigos de longa data a partir de então, tendo ambos dividido um apartamento após o término do casamento deste com Sullavan, em 1933.
Conseguiu uma bem sucedida carreira nos palcos da Broadway antes de começar a atuar no cinema em 1935, com Entre a Honra e a Lei, filme estrelado por Spencer Tracy. Em 1939, após intercalar protagonistas, Stewart chama a atenção de vez do público em A Mulher Faz o Homem de Frank Capra, onde interpreta o ingênuo Jefferson Smith, sendo indicado ao Oscar de Melhor Ator. Neste filme, James começou a interpretar o papel do qual mais seria reconhecido em sua carreira, o do idealista convicto.
Em 1941, já com status de estrela, James Stewart foi o primeiro ator a alistar-se na Força Aérea Americana, ingressando como soldado e chegando ao posto de coronel ao final da Segunda Guerra Mundial.
Após a guerra, James casou-se com a ex-modelo Gloria Hatrick McLean, em 9 de agosto de 1949. Eles permaneceriam casados até a morte dela em 16 de fevereiro de 1994. Stewart adotou os dois filhos de sua mulher, Michael e Ronald, e juntos tiveram as gêmeas Judy e Kelly, nascidas em 7 de maio de 1951.