Γεννήθηκε στις 8/20 Απριλίου 1851[2] στην Κέρκυρα και ήταν γιος του νομισματολόγου Παύλου Λάμπρου που είχε καταγωγή από την Ήπειρο. Το 1860 μετακόμισε στην Αθήνα με την οικογένεια του, όπου συνέχισε τις εγκύκλιες σπουδές του: τα μαθήματα του ελληνικού σχολείου τα διδάχθηκε κατ' οίκον (1860–1863) , τα δε γυμνασιακά στο 2ο Γυμνάσιο Αθηνών (1863–1867), ενώ σπούδασε φιλολογία στο Εθνικό Πανεπιστήμιο (1867–1871). Στη συνέχεια πραγματοποίησε μεταπτυχιακές σπουδές στο Πανεπιστήμιο του Βερολίνου και της Λειψίας, όπου αναγορεύθηκε διδάκτωρ φιλοσοφίας το 1873. Η διατριβή του είχε τίτλο «Τα κατά τους οικιστάς των παρ’ Έλλησιν αποικιών και τας αυτοίς απονεμημένας τιμάς και προνομίας». Από το 1875 και έως το 1878 πραγματοποίησε επιπλέον μελέτες και σπουδές στην Ευρώπη: Γερμανία, Ολλανδία, Γαλλία, Βέλγιο, Αγγλία, Αυστρία, Ιταλία.[3] Το 1877 επέστρεψε στην Ελλάδα και τον επόμενο χρόνο διορίστηκε υφηγητής της ελληνικής ιστορίας και γραφογνωσίας στο Πανεπιστήμιο Αθηνών. Στη συνέχεια υπηρέτησε ως γενικός επιθεωρητής Δημοτικής Εκπαιδεύσεως και το 1890 έγινε τακτικός καθηγητής της ελληνικής ιστορίας και της Παλαιογραφίας στο Πανεπιστήμιο Αθηνών[4], ενώ διετέλεσε δύο φορές πρύτανης του πανεπιστημίου (1904–1905 και 1911–1912)[5] και τρεις φορές κοσμήτορας της Φιλοσοφικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών (1893–1894, 1909–1910 και 1914–1915)[6].
Η πρώτη του εμφάνιση στα γράμματα έγινε το 1861, μαζί με τον αδερφό του Μιχαήλ, όταν και ίδρυσαν το χειρόγραφο περιοδικό «Παρνασσός» και στις 24 Ιουνίου 1865 τον ομώνυμο Φιλολογικό Σύλλογο.[4][11] Το 1870 έλαβε τον πρώτο έπαινο στο Βουτσίνειο δραματικό διαγωνισμό για το έμμετρο δράμα του «Ο τελευταίος κόμης των Σαλώνων». Στη συνέχεια δημοσίευσε ποιήματα, δοκίμια κριτικού περιεχομένου, θεατρικά έργα έως το 1873, όταν και αφοσιώθηκε στην επιστημονική έρευνα. Η έρευνα του αυτή σχετίστηκε με τη βυζαντινή, μεσαιωνική και νεώτερη ελληνική γραμματεία, και θεωρήθηκε συνεχιστής του έργου του Σπυρίδωνος Ζαμπέλιου και του Κωνσταντίνου Παπαρρηγόπουλου. Στο έργο του συγκαταλέγονται 500 δημοσιευμένες και 280 εκδιδόμενες μελέτες, οι οποίες δημοσιεύθηκαν μετά το θάνατό του από τη σύζυγο και τις κόρες του. Από το 1903 εξέδιδε το περιοδικό «Νέος Ελληνομνήμων», ενώ ως μέρος του παλαιογραφικού του έργου είναι η αποκατάσταση και δημοσίευση χειρογράφων της βυζαντινής γραμματείας.[4] Με αφορμή την επέτειο των εκατό χρόνων από τον θάνατο του Σπυρίδωνος Λάμπρου, το Τμήμα Ιστορίας και Αρχαιολογίας και το Ιστορικό Αρχείο του Πανεπιστημίου Αθηνών συνδιοργάνωσαν, στις 12-13 Δεκεμβρίου 2019, συνέδριο με θέμα: «Σπυρίδων Λάμπρος. Ο ιστορικός, το έργο και η εποχή του».
Σπυρίδων Λάμπρος (1892). Αποκαλύψεις περί του μαρτυρίου του Ρήγα. Αθήναι: Εστία.
Σπυρίδων Λάμπρος (1896). Οι Ευεργέται και Καθηγηταί του Εθνικού Πανεπιστημίου. Αθήνα: Εστία.
Σπυρίδων Λάμπρος, Ν. Γ. Πολίτης (1896). Die Olympischen Spiele 776 - 1896 (Τόμος Α΄)(PDF). Αθήνα, Λειψία, Λονδίνο: Καρλ Μπεκ, F. Volckmar, H. Grevel and co. Αρχειοθετήθηκε από το πρωτότυπο(PDF) στις 16 Ιανουαρίου 2013. Ανακτήθηκε στις 14 Απριλίου 2010.
1Πρωθυπουργός πραξικοπηματικής κυβέρνησης. 2Πρωθυπουργός κυβέρνησης που δεν ελέγχει την Αθήνα. 3Υπό διαφορετικό τίτλο. 4Πρωθυπουργός της "Ελληνικής Πολιτείας" κατά τη διάρκεια της Κατοχής. 5Υπηρεσιακός πρωθυπουργός.