Efter föräldrarnas skilsmässa 1951 växte Brost upp med sin mor.[3] Som barn ville Brost inte välja samma yrke som mor. Gudrun Brost var en stor aktris och Johannes Brost växte upp bland teaterkulisser. Tids nog valde Brost i alla fall att satsa på teater och sökte till Dramatens elevskola men det brast i första provet. Efter privatlektioner för Fred Hjelm blev han antagen till Statens scenskola i Malmö och utexaminerades 1970.[4]
Brost långfilmsdebuterade 1976, i rollen som handelsresande i filmen Förvandlingen efter Franz Kafkas berättelse.[9] Han fick sitt stora genombrott 1981 i julkalendern Stjärnhuset i rollen som Astro, och han gjorde under 80-talet en lång rad uppmärksammade teaterroller i komedier som Bäddat för sex och Är du inte riktigt fisk. Under samma period etablerade han sitt säregna humoristiska uttryck och sin pantomimiska begåvning i TV-serien Gäster med gester.[10]
Mellan 1992 och 2002 medverkade Johannes Brost i SVT:s långkörare Rederiet. Hans karaktär, bartendern Joker, blev en av de mest populära och Brost en av Sveriges mest igenkända skådespelare; han medverkade i 318 avsnitt av TV-serien.[11] Han medverkade även i flera långfilmer, bland annat Bröllopsfotografen, Black Jack, Änglagård, Jönssonligan dyker upp igen och som mystisk spökjägare i Besökarna.
År 2011 hade Johannes Brost huvudrollen i Axel Peterséns debutlångfilm Avalon. För denna roll tilldelades han en Guldbagge i kategorin Bästa manliga huvudroll i januari 2013.[13] Rollen kom att bli ett erkännande för hans talang som skådespelare.[2]
