Son père, Edwin Arnold Spacek, un agent agricole, est d'origine tchèque (Moravie) et allemande. Sa mère, Virginia Frances Spilman, dont les ancêtres sont d'origines polonaise et irlandaise, est née au Texas.
La jeunesse de Sissy Spacek est marquée par la mort de Robbie, son jeune frère de 18 ans, en 1967.
Elle travaille un temps comme mannequin et, comme figurante, à la Factory de Andy Warhol. Elle apparaît d'ailleurs à cette époque comme figurante dans le film Trash (1970) de Paul Morrissey.
Pour son premier rôle crédité, dans le film culte Carnage (Prime Cut), en 1972, elle interprète Poppy, une jeune fille vendue comme esclave sexuelle. Son interprétation est remarquée et lui permet de décrocher quelques rôles à la télévision. En 1973, elle obtient une reconnaissance internationale après avoir joué, dans La Balade sauvage (Badlands) de Terrence Malick, la jeune Holly, narratrice du film et une ancienne petite amie de 15 ans d'un criminel incarné par Martin Sheen. Sur le plateau de ce film, elle rencontre le directeur artistiqueJack Fisk, qu'elle épouse.
Rôle emblématique de sa carrière, Carrie White dans Carrie au bal du diable (Carrie), de Brian De Palma, en 1976, vaut à Sissy Spacek d'être nommée à l'Oscar de la meilleure actrice. Deux ans plus tôt, elle avait été habilleuse sur le plateau du Phantom of the Paradise du même réalisateur. Aussi avait-elle eu fort à faire pour le convaincre de l'engager pour ce rôle et s'était présentée à l'audition après avoir mis de la vaseline dans ses cheveux et enfilé une vieille robe confectionnée par sa mère du temps de son enfance.
Après Carrie, Spacek joue la gouvernante Linda Murray dans Bienvenue à Los Angeles (Welcome to L.A.) d'Alan Rudolph en 1976, et l'année suivante, donne une solide performance en Pinky Rose dans Trois femmes (3 Women) de Robert Altman. Ce rôle confirme l'importance de l'actrice dans le milieu du cinéma indépendant, d'autant qu'elle contribue alors au financement de Eraserhead (1977), le premier film de David Lynch, qui la remercie au générique.
Elle est de nouveau nommée pour l'Oscar de la meilleure actrice en 2001 pour le rôle bouleversant de Ruth Fowler dans le drame In the Bedroom de Todd Field. Également à l'aise dans la comédie et les seconds rôles, elle est une désopilante Missus Walters dans La Couleur des sentiments (The Help), réalisé par Tate Taylor en 2011.