Gyermekkorát bátyjával, Fülöppel, valamint húgával, Johannával töltötte Toledóban és Valladolidban. Fivéréhez hasonlóan erős és határozott személyiség lett, egyben buzgó és mélyen vallásos katolikus. Anyjuk 1539-ben elhunyt, amikor Mária mindössze tíz éves volt. Halálával a fiatal infánsnő lett az udvar legmagasabb rangú hölgye. Uralkodói kötelezettségeiből adódóan apjuk rendszeresen volt távol huzamosabb ideig, ennek ellenére szoros kapcsolatot tudott kialakítani gyermekeivel.
Az ifjú házasok kezdetben Spanyolországban éltek. Mivel apját, a császárt a német ügyek kötötték le, fivére, Fülöp infáns pedig távol volt a spanyol udvartól, így Mária és Miksa lett a birodalom régense 1548 és 1551 között. 1552-ben végül átköltöztek a Szent Római Birodalomba Miksa apjának, Ferdinándnak udvarába, Bécsbe. Miután apja lemondott császári és spanyol királyi címéről (előbbiről testvére, utóbbiról fia javára), Mária 1558-ban ismét visszatért hazájába, hogy az Angliában tartózkodó testvére nevében kormányozza az országot 1561-ig – régensi tisztségében húgát, Johannát követte.
A mélyen vallásos Mária császárné egész Ausztriában való tartózkodása során rosszul érezte magát és visszavágyott hazájába, a szigorúan katolikus spanyol udvarba. Buzgón támogatta a katolicizmust, és elítélte férje vallási toleranciáját, amit a protestánsok iránt tanúsított. Hithű katolikus spanyol személyekkel vette körül magát: közeli barátja és udvarhölgye Margarita de Cardona nemesasszony volt, udvartartását Maria de Requenes szervezte spanyol módra.
Mária császárné nagy befolyást gyakorolt gyermekeire. Két fiát is testvére, II. Fülöp spanyol király udvarába küldte, hogy biztosítsa számukra a szigorú katolikus neveltetést. Fivérével folyamatos levelezésben volt, ezzel biztosította a Habsburg-ház spanyol és osztrák ágai közötti jó viszonyt, ami férje protestánsokkal való toleranciája miatt megromlott a két család között. 1570-ben legidősebb leánya esküvőjét szervezte Asztúria hercegével, az esküvőre azonban nem került sor, a leány nagybátyához, Mária testvéréhez, Fülöp királyhoz ment feleségül. Másik leánya, Erzsébet esküvőjére a francia királlyal, IX. Károllyal szintén 1570-ben került sor. A francia királyi párnak egy leánya született: Mária Erzsébet, akinek keresztszülei Mária császárné és I. Erzsébet angol királynő lett 1573-ban.
1581 végén visszaindult leányával, Margittal szeretett hazájába, Spanyolországba. A főhercegnő végül nem lett nagybátyja ötödik felesége, ugyanis Madridban klarissza apácának állt. Mária számos eseményt befolyásolt a spanyol udvarban is: erősen katolikus és osztrákbarát politikai frakciót alkotott fivére, majd unokaöccse, III. Fülöp spanyol király udvarában; leányával, Margittal, valamint az új királynéval (egyben unokahúgával), Ausztriai Margittal egy erős befolyásos kört alkotott, jelentős hatást gyakorolva a királyra Lerma hercegével és annak politikájával szemben.
Ez a szócikk részben vagy egészben a Maria of Austria, Holy Roman Empress című angol Wikipédia-szócikk fordításán alapul. Az eredeti cikk szerkesztőit annak laptörténete sorolja fel. Ez a jelzés csupán a megfogalmazás eredetét és a szerzői jogokat jelzi, nem szolgál a cikkben szereplő információk forrásmegjelöléseként.