המשרד מנוהל בעזרת אגפים, רשויות וחברות ממשלתיות: מינהל תכנון ופיתוח תשתיות הכולל את המפקחים על התעבורה, אגף תשתיות ופיתוח, אגף תכנון תחבורתי; מינהל התנועה הכולל אחריות על תקינת הרכבים, רישוי נהגים ורכבים, יצוא ויבוא כלי רכב; הרשות הארצית לתחבורה ציבורית מפקחת על התחבורה הציבורית בישראל ועל פעילותה ואילו רשות התעופה האזרחית מפקחת ומסדירה את תחום התעופה האווירית בישראל; למשרד מסונפים גם השירות המטאורולוגי הישראלי, המספק שירותי חיזוי של מזג האוויר; ואגף הביטחון.
למשרד התחבורה והבטיחות בדרכים יחידות מטה אשר מספקות מידע ועבודות מטה עבור שר התחבורה ומנכ"ל המשרד, בין השאר, אגף לייעוץ משפטי, אגף לתכנון כלכלי, אגף ביקורת ומינהל הון אנושי.
על תחום הבטיחות בדרכים אחראית משנת 1997הרשות הלאומית לבטיחות בדרכים, עד אז הפעילות בתחום זה נעשתה במסגרת המינהל לבטיחות בדרכים שהיווה אגף במשרד. כיום מנוהלת הרשות הלאומית לבטיחות בדרכים כרשות עצמאית סטטוטורית הכפופה ישירות לשר התחבורה והבטיחות בדרכים ומהווה זרוע מקבילה למשרד בתחום הבטיחות בדרכים.
ב-5 בינואר2012 החליטה ממשלת ישראל לשנות את שם המשרד למשרד התחבורה, התשתיות הלאומיות והבטיחות בדרכים על מנת לתת ביטוי הולם לאחריות המשרד בתכנון וביצוע תשתיות התחבורה בישראל. בספטמבר 2013 שונה שם המשרד למשרד התחבורה והבטיחות בדרכים.[1]
משרד התחבורה שוכן בבניין ג'נרי בקריית הממשלה בירושלים ביחד עם משרד הכלכלה ומשרד התיירות.
הרשות אחראית על הסדרתה של התעופה האזרחית בהתאם לדין הבינלאומי. יעדיה כוללים שמירה על רמת בטיחות טיסה מירבית, פיתוח התעופה, רמת שרות נאותה למשתמשים בשירותי ההובלה האווירית ועוד.
החברה אחראית על הקמת, פיתוח ותחזוק את נמלי הים המסחריים של מדינת ישראל בחיפה, באשדוד ובאילת ואת הנמלים החדשים שהקימה החברה: נמל הדרום באשדוד ונמל המפרץ בחיפה.
חברה ממשלתית האחראית לפיתוח תשתיות התחבורה בישראל. החברה עוסקת בתכנון, פיתוח ואחזקת מרבית הכבישים הבינעירוניים, הקמת מסילות רכבת, ביצוע פרויקטים במרחב העירוני והמטרופוליני והקמת שדה תעופה בינלאומי חדש (המיועד לטיסות חסך).