Antefatto Quindici anni prima dell'inizio del dramma, Semiramide cospira con il principe Assur per uccidere il marito Nino. Dopo il regicidio, Ninia, figlio di Nino, viene sottratto da Oroe alle mire di Assur. Per proteggerlo, egli lo porta dal fratello Fradate.
Atto I
Magnifico tempio eretto a Belo, festivamente adornato Oroe, gran sacerdote, apprende dal Gran Nume che il regicidio sta per essere vendicato (Sì, gran nume). Successivamente entrano indiani e satrapi per apprendere la designazione del re (Belo si celebri, Belo si onori). Tra questi vi sono il principe indiano Idreno, e il nobile Assur; quest'ultimo è convinto di diventare re, e questo fa indignare Oroe, dato che sa che è coinvolto nel regicidio. Entrata Semiramide, ella si appresta a nominare il nome del re, ma il sacro fuoco si spegne. Oroe spiega che è un segno dello sdegno divino, e afferma che prima che il re sia incoronato, alcune colpe devono essere punite: Assur e Semiramide intendono, spaventati, e la regina si ritira. Nel frattempo, convocato dalla regina stessa ritorna alla madrepatria Arsace (Eccomi alfine in Babilonia); il giovane esulta, poiché spera di rivedere l'amata Azema. Oroe accoglie Arsace di buon grado, mentre Assur si irrita per il suo ritorno, dato che anch'egli ama Azema (duetto: Bella imago degli dei) e spera di strapparla all'odiato rivale. Dal canto suo, Azema stessa si rallegra per il ritorno di Arsace; ma di lei è innamorato anche Idreno (Ah, dov'è il cimento), che spera di poter ottenere da Semiramide il favore di sposarla.
Giardini pensili La regina attende l'arrivo dell'amato (Bel raggio lusinghier). Il soldato Mitrane le reca il responso dell'Oracolo di Giove Libico: la pace arriverà con il ritorno di Arsace, e convolando a nuove nozze. Arriva Arsace, il quale giura eterna fedeltà alla sua regina, confidando nel suo appoggio per sposare Azema; ma la regina equivoca, convinta che Arsace aspiri a sposarla. (Alle più care immagini).
Luogo magnifico nella reggia con veduta di Babilonia Il popolo è radunato nella reggia per attendere l'annuncio del nuovo re (Coro e marcia Ergi omai la fronte altera). Semiramide esorta tutti a giurare fedeltà ai suoi voti e al nuovo re, e annuncia che l'eletto sarà anche suo sposo: Arsace. Azema è sconvolta, Arsace confuso, Oroe sconvolto, Assur indignato; il satrapo ricorda a Semiramide i suoi favori, ma la regina lo minaccia. Idreno allora chiede la mano di Azema, e la regina gliela concede. Mentre Semiramide esorta Oroe a celebrare il rito, la terra trema, e si apre il sepolcro dell'imperatore. L'ombra di Nino appare, annunciando che Arsace regnerà solamente quando il suo assassinio sarà vendicato, con una vittima offerta sulla sua tomba; il giovane giura di obbedire al funesto compito. L'atto si conclude nell'unanime turbamento (Ah, sconvolta nell'ordine eterno).
Atto II
Atrio Assur è adirato con la Regina, dato che Semiramide ha violato i patti di quindici anni prima. Assur le ricorda la sua colpevolezza, ma Semiramide è rassicurata dai festeggiamenti nella reggia per Arsace, e confida nella sua protezione.(Se la vita ancor t'è cara)
Interno del santuario Nel tempio, Oroe mostra ad Arsace la lettera che Nino morente aveva mandato a Fradate, e al giovane viene rivelata la sua identità: egli è Ninia, legittimo erede al trono. I sacerdoti lo esortano a compiere la giusta vendetta, sia su Assur che su Semiramide. Arsace vuole vendicare il padre, ma non se la sente di uccidere anche la madre (In sì barbara sciagura).
Appartamenti di Semiramide Azema si rattrista per la sua sorte con Mitrane. Entra Idreno, che le giura che l'amerà per sempre (La speranza più soave), e i due si affrettano alle nozze al tempio. Semiramide raggiunge Arsace, che continua a fuggirla, e le spiega il motivo del suo turbamento, mostrandole la lettera di Nino morente. Semiramide, sconvolta, esorta il figlio a vendicare il padre (Ebben...a te, ferisci). Arsace però la rassicura, dicendo che ucciderà solo Assur, e si allontana da lei.
Parte remota della reggia, attigua al mausoleo di Nino Assur viene informato dai Satrapi di essere caduto in disgrazia presso la regina e tutto il popolo. Assur, in preda al delirio, rivede il fantasma di Nino; i Satrapi lo riscuotono, ed egli si dichiara pronto a sfidare la sua sorte. (Que' numi furenti).
Interno sotterraneo nel mausoleo di Nino I magi discendono assieme ad Arsace, per uccidere il traditore (Un traditor, con empio ardir). Anche Assur si è nascosto nella tomba, per poterlo uccidere, e scende anche Semiramide, a pregare sulla tomba del marito. Nell'ombra, sentendo i reciproci lamenti, i tre sono indecisi sul da farsi, ed è solo l'ordine di Oroe che muove Arsace alla vendetta. Ma a morire ucciso da lui non è Assur, ma sua madre Semiramide, scambiata per Assur nell'oscurità. Oroe condanna a morte Assur, ma questi, trionfante, indica il corpo morto della regina; Arsace, sconvolto, fa per suicidarsi, ma Oroe lo ferma, e il popolo entra festante, proclamandolo imperatore.
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