Lorsque les conservateurs sont dans l'opposition, elle est porte-parole en matière d'Affaires intergouvernementales, de 2004 à 2006. Le , elle fait la une des journaux après avoir adressé une remarque cinglante à la Chambre des communes à l'endroit du ministre libéral du Développement social de l'époque, Ken Dryden, lui disant que « les femmes qui travaillent veulent faire leurs propres choix, nous n'avons pas besoin que de vieux hommes blancs nous disent quoi faire », en référence au plan libéral d'instaurer un réseau national de garderies.
Ambrose est considérée comme une représentante forte du conservatisme canadien : une jeune femme à l'aise face à la grosse bureaucratie gouvernementale, un sujet de colère pour les prédécesseurs de son parti du Parti réformiste et de l'Alliance canadienne. Elle est parfois mentionnée comme une candidate potentielle à la direction du Parti conservateur. Ambrose est temporairement critique de l'opposition en matière de Commerce international après la défection de Belinda Stronach vers le Parti libéral.
Elle est ministre des Affaires intergouvernementales du au , ministre du Travail du au , puis ministre des Travaux publics et des Services gouvernementaux du au , ainsi que ministre de la Condition féminine du au . Le , elle appelle au boycott des bananes Chiquita dont les dirigeants refusent du pétrole en provenance de sables bitumineux de l'Alberta afin de diminuer leur empreinte écologique[3],[4].
Le , Rona Ambrose vote en faveur de la motion M-312 du député conservateur pro-vie Stephen Woodworth. Cette motion vise à procéder à une étude de la définition de l'« être humain » qui se retrouve dans le Code criminel canadien. Selon ses opposants, cette motion pourrait avoir pour effet de rouvrir le débat sur le droit à l'avortement. La motion controversée M-312 est finalement défaite (203 contre, 91 pour) à la Chambre des communes et les députés n'auront pas à former de comité spécial pour déterminer si le fœtus devrait être considéré comme un être humain en vertu de l'article 223 du Code criminel du Canada. Elle est ministre de la Santé du au .
Chef intérimaire du Parti conservateur
Lors des élections fédérales de 2015, le Parti conservateur est défait et son chef Stephen Harper annonce sa démission. Le , Rona Ambrose est désignée chef par intérim du parti et donc de l'opposition officielle[5]. Le , elle annonce qu'elle se retire de la politique à la fin de la session parlementaire[6].