James Rothman 1950-ben született a massachusettsi Haverhillben, zsidó családban. Apja, Martin Rothman gyerekgyógyászként praktizált; anyja Gloria Hartnick háztartásbeli volt. James a legidősebb volt a három fiútestvér közül; öccsei közül Richard farmakológus-pszichiáternek, John jogásznak tanult. Az általános iskolában főleg a fizika és matematika érdekelte, elektromos készülékeket szerelt össze és rakétát épített. Középfokú tanulmányait a Pomfret School benlakásos magániskolában végezte és olyan jól teljesített, hogy a szokásos négy év helyett két év után érettségizett. Tanulmányait 1967-től a Yale Egyetemen folytatta, ahol elméleti fizikusnak készült. Apja hatására - aki főleg amiatt aggódott, hogy egy elméleti fizikus nem kap megfelelő állást - elkezdte látogatnia a biológiaelőadásokat is. Abban, hogy Rothman a biokémiát választotta, nagy szerepe volt Harold Morowitznak, aki a biológiai membránok tulajdonságait vizsgálta és laboratóriumában a diák Rothman elkezdhette első kutatásait. A membránokról írt szakdolgozata a legjobbnak járó díjat kapta az évfolyamában (érdekesség, hogy témavezetője az összefoglalót limerickekben írta, ami nagy sikert aratott a humán tudományok professzorait is magába foglaló bírálóbizottságban).
A BSc oklevél megszerzése után apja hatására 1971-ben a Harvard Egyetem orvosi szakán tanult tovább, bár Rothman úgy tervezte, hogy praktizálás helyett a kutatást választja pályájául. Orvosi doktorátusával párhuzamosan egy egyetemi programon belül 1976-ban megszerezte a PhD fokozatot is, témája a sejt membránjainak bioszintézise volt.
Pályafutása
Doktorátusának megszerzése után 1976-ban a Massachusetts Institute of Technology biológia szakán dolgozott kutatói ösztöndíjjal. 1978-tól a Stanford Egyetem biokémiai tanszékén oktatott egészen 1988-ig, majd a Princeton Egyetem molekuláris biológia professzoraként folytatta pályafutását. 1991-ben megalakította és 2004-ig vezette a Sloan-Kettering Rákkutató Központ sejtbiokémiai és -biofizikai részlegét. 2004-től a Columbia Egyetem tanára és a Sulzberger Genomkutató Központ igazgatójaként dolgozott, majd 2008-ban átment a Yale Egyetemre.
Rothman a sejt részei (kompartmentumai) közötti anyagszállítás molekuláris mechanizmusait kutatta. Eredményei segítettek megérteni, hogyan kerül az inzulin a citoplazmából a vérbe, hogyan kommunikálnak az idegsejtek vagy hogyan jutnak be a vírusok a gazdasejtbe. Ezeket a folyamatokban kicsiny, lipidmembránnal körbevett vezikulumok szállítják a kémiai anyagokat a célállomásra. Az élettan és a klinikum számára különösen nagy jelentőségű a vezikulumok érkezésekor lejátszódó membránfúziós lépés, amelynek hibás működése anyagcsere-, neurológiai vagy más betegségek okozója lehet. Rothman 1984-ben kezdődő munkájában sejtmentes rendszerben vizsgálta a vezikulumok létrejöttét és fúzióját és 1993-ban felfedezte a membránfúziót szabályozó SNARE proteineket. Szintén ő fedezte fel azt a GTP-hasítással járó rendszert, amely a vezikulumok bimbózását (létrejöttét) kontrollálja.
Rothman ezenkívül tanulmányozta a neurális hálózatokat, felfedezte a hsp70hősokkproteinATP-hasító aktivitását és fehérjekötő képességét. 1981-ben kidolgozott egy modellt a Golgi-készülék működéséről, amely szerint ciszternái a fehérjék több lépéses tisztítását szolgálják; az elmélet ma általánosan elfogadott.