יוסטינוב נולד בלונדון בשם פיטר אלכסנדר פון יוסטינוב, ליונה פון אוסטינוב,[1] יליד ירושלים ובנו של הברון פלטון פון אוסטינוב ממוצא גרמני-רוסי, אתיופי-אריסטוקרטי ויהודי ולאם ממוצא רוסי, צרפתי ואיטלקי. למד בבית ספר וסטמינסטר, וכבר בגיל 17 הופיע לראשונה על במת התיאטרון. ובגיל 19 שיחק. במלחמת העולם השנייה שירת בצבא בעשיית סרטי תעמולה עם שחקנים כמו דייוויד ניבן, ופנה גם לכתיבת תסריטים ומחזות. בשנת 1950 הצטלם בסרט בסרט וגילם את אדולף רבינוביץ'. הצלחתו הראשונה הייתה ב-1951 עם "אהבת ארבעת הקולונלים". הוא המשיך לכתוב מחזות במקביל לעבודתו כשחקן, שהידוע שבהם הוא "רומנוף וג'ולייט" מ-1956. בין מחזותיו הבולטים היה גם "סוף המירוץ" שהוצג בתיאטרון "הבימה" בסוף שנות השישים. באוטוביוגרפיה שכתב "Dear Me", הוא מתאר את חייו ובעיקר את ילדותו כשהוא מתשאל את עצמו. כמו כן פרסם מספר ספרים, הטוב שבהם -"הגיבור" (1964), רומן על רקע השואה.
בין תפקידיו בקולנוע היו הקיסר נירון בסרט "קוו ואדיס", קפטן ויר ב"בילי באד", לנטולוס בטיאטוס ב"ספרטקוס", וגילם את הרקול פוארו, גיבור ספריה של אגתה כריסטי, במספר סרטים שהראשון בהם היה "מוות על הנילוס" ב-1978. ב-1964 נבחר לגלם את המפקח קלוזו, בסדרת סרטי הפנתר הוורוד, אך פרש ברגע האחרון ונתבע למשפט על ידי חברת האחים מיריש, פיטר סלרס הוא שגילם לבסוף את התפקיד.
יוסטינוב כתב תסריטים וביים סרטים ביניהם "Vice Versa", "רומנוף וג'ולייט" (לפי המחזה שכתב), ו"ליידי L" (לפי ספר של רומן גארי). מבין הסרטים שביים השאפתני ביותר היה הניסיון לעבד לקולנוע את ספרו האלגורי של הרמן מלוויל "בילי באד".
בסוף שנות השישים התאזרח בשווייץ, כדי להימנע מתשלום מיסים גבוהים בבריטניה, למרות זאת קיבל ב-1990 תואר אבירות ממלכת בריטניה.
יוסטינוב היה נשוי שלוש פעמים והיה אב לארבעה. הוא נפטר ב-28 במרץ 2004 בשווייץ. יוסטינוב נהג להתבטא בנושאים פוליטיים ונודע בביקורותו על ממשלות ישראל בסוגיה הפלשתינאית.
^בנו של פון אוסטינוב, יונה פון אוסטינוב (Jona von Ustinov), יצא לרוסיה כדי להתחקות אחר עקבותיו של אביו. לימים הוא היה לעיתונאי ולדיפלומט, ושימש כמרגל מטעם ה-MI5 בגרמניה הנאצית. בנו של יונה ונכדו של פון אוסטינוב היה השחקן הבריטי פיטר יוסטינוב.