בוולשטיין החל קוך להתמקד בחקר הגחלת (אנתרקס). באותה תקופה המחלה הייתה נפוצה בקרב פרות וחיסלה לעיתים עדרים שלמים וגרמה גם מוות בקרב בני אדם. באותו זמן קוך היה ללא הכשרה במחקר, מנותק מהקהילה המדעית, ומספריות מדעיות, וכמעט ללא ציוד מדעי. כמו כן הוא היה רופא עסוק עם פציינטים רבים. למרות כל זאת הוא החל לחקור את המחלה.[1] המעבדה שעמדה לרשותו הייתה ממוקמת בדירה בת 4 החדרים בה גר, והציוד המרכזי שהיה לו היה מיקרוסקופ שקיבל כמתנה מאשתו, וכן ציוד שהכין במו ידיו.[2][1]
עוד קודם לכן קזימיר דאוויין הראה קיום העברה ישירה של מתגיגחלת (anthrax bacillus) בין פרות. קוך החליט לאשש באופן מדעי כי חיידק זה הוא באמת סיבת המחלה. הוא לקח חיידקים מדם של חיות משק שמתו זה מכבר מגחלת, והשתמש בכפיסי עץ שהכין בעצמו כדי להחדיר את החיידקים לעכברים, וגילה כי כל העכברים מתו בתוך זמן קצר. בה בעת הוא לקח דם של חיות בריאות והחדיר אותו לעכברים אחרים, וכל העכברים האלה לא סבלו מהמחלה. דבר זה אישש ממצאים של חוקרים אחרים שהראו כי ניתן להעביר את המחלה באמצעות דם של חיה שחלתה בגחלת.[1]
ממצאים אלה לא השביעו את רצונו של קוך. הוא רצה לדעת האם חיידק, שלא היה מעולם בקשר עם חיה חולה, יכול לגרום למחלה אצל חיה בריאה אחרת. ייתכן לדוגמה כי גורמים אחרים בדם החיה החולה מעבירים את המחלה.[3]
כדי לענות על שאלה זו קוך המציא שיטות לגדל תרביות טהורות של חיידקי bacillus, בנוזל שנלקח מעין של פר שהומת קודם לכן. הוא מצא שיטות לחקור, לצייר ולצלם תרביות אלה ותיעד את התרבות החיידקים. הוא שם לב גם שכאשר התנאים הפכו לא-נוחים לחיידקים (כמו מחסור בחמצן), הם יצרו נבגים שיכלו להתמודד עם התנאים הקשים, וכאשר התנאים השתפרו מחדש, הם חזרו לחיות כחיידקים פעילים.[1] כך גילה קוך שעל אף שחיידקי האנתרקס לא יכולים לשרוד בצורתם המקורית מחוץ לגוף במשך זמן רב, הם מפתחים נבגים שיכולים להחזיק מעמד זמן רב. כשנבגים אלה נמצאו בקרקע הם גרמו להתפרצויות "ספונטניות" ובלתי מוסברות של המחלה. קוך גידל מספר דורות של חיידקים בתרביות טהורות אלה. לאחר מכן החדיר את החיידקים לעכברים והראה שאף על פי שחיידקים אלה לא היו בקשר עם בעלי חיים הם יכלו עדיין לגרום לגחלת. דבר זה היה פריצת דרך באישוש תאוריית החיידקים כגורמי מחלות משום שהצביע על כך שניתן להעביר את המחלה באמצעות חיידקים שלא הגיעו ישירות מחיה חולה.
קוך הציג את ממצאיו בפני פרדיננד כהן, פרופסור לבוטניקה מאוניברסיטת ברסלאו (כיום ורוצלב בפולין). כהן כינס את עמיתיו כדי להתבונן בהדגמה של קוך, ביניהם היה גם הפרופסור לפתולוגיה ואנטומיהיוליוס כהנהיים. כהן וכהנהיים התרשמו עמוקות מעבודתו של קוך. בשנת 1876 פרסם כהן את עבודתו של קוך בירחון הבוטני שהוא היה עורכו. בתוך זמן קצר הפך קוך לאדם מפורסם. עם זאת הוא המשיך לעבוד כרופא בוולשטיין במשך 4 שנים נוספות. במהלך תקופה זו הוא שכלל את שיטות העבודה שלו לקבע, לצבוע ולצלם חיידקים. כמו כן הוא המשיך לבצע עבודה חשובה של חקר מחלות שנגרמו על ידי זיהום חיידקי של פצעים, ופרסם את תוצאותיו ב-1878. בעבודה זו, כמו בנושא הגחלת, הוא סיפק בסיס מדעי ומעשי לבקרת הזיהום והמחלה.[1]
בעקבות פרסומו של קוך הוא קיבל ב-1880 משרה במשרד הבריאות הקיסרי בברלין. בברלין שיפר את השיטות בהן השתמש בוולשטיין, כולל שיטות צביעה ובידוד, ושיפור מצעי גדילה לחיידקים, כולל צלחות אגר וצלחות פטרי, בהם משתמשים עד היום. בעזרת שיטות אלה הצליח לגלות ב-1882 את החיידק שגורם למחלת השחפת, "Mycobacterium tuberculosis". הוא פרסם את תגליתו ב-24 במרץ בכנס של החברה הפיזיולוגית בברלין. מכיוון שבתקופה זו הייתה השחפת גורם תמותה מרכזי, ממנה מת בממוצע כל גרמני שביעי, גילויו העלו אותו לרמת החשיבות של לואי פסטר במחקר הבקטריולוגי.
מלבד עבודתו החשובה בחקר השחפת, עליה קיבל פרס נובל, יש חשיבות גדולה גם לאקסיומות של קוך, אשר אומרות שבשביל לקבוע שאורגניזםפתוגני, גורם למחלה, צריך להראות כי הוא:
נמצא בכל מקרי המחלה שנבדקו
הוכן והוחזק בתרבית טהורה
הצליח לגרום להדבקה במחלה המקורית גם לאחר כמה דורות בתרבית
יכול להתקבל מחדש מחיות שהודבקו בו ולהתרבות שוב בתנאי מעבדה
אחרי הצלחתו החלה רמת המחקר שלו להתדרדר, בייחוד אחרי שערוריית ה"טוברקולין". בשנת 1890 הציג בקונגרס הבינלאומי העשירי לרפואה תרופה נגד שחפת בשם טוברקולין, שאת נוסחתה שמר קוך בסוד. התרופה התקבלה בהתלהבות גדולה, בהסתמך על המוניטין של ממציאה וקוך זכה בשל כך בעיטור הוקרה מטעם הממשל הפרוסי. בתוך זמן מה התברר שהתרופה איננה יעילה ורבים מהחולים שקיבלו אותה מתו.
