Luostari sai alkunsa 1200-luvulla, kun paikallinen lammaspaimen löysi Guadalupejoen rantapenkasta Madonnan patsaan. Patsas oli luultavasti piilotettu maurien valloituksen aikana vuoden 714 paikkeilla. Patsaan löytöpaikalle rakennettiin kappeli. Kuningas Alfonso XI arveli patsaan edessä rukoilemisen siivittäneen hänet merkittävän taistelun voittoon ja teki kappelista kuninkaallisen pyhiinvaelluskohteen. [1] Vuonna 1389 siitä laajennettiin luostari.
Luostarin sairaalat ja lääketieteellinen koulu olivat kuuluisia, sen scriptoriumissa ja kirjastossa on monipuoliset kokoelmat ja monet tunnetut taiteilijat työskentelivät siellä.[1]
Luostarilla on ollut monipuolinen yhteys Espanjan siirtomaihin Etelä- ja Keski-Amerikassa. Täällä Kolumbus kiitti Jumalaa Amerikan löytämisestä. Guadalupen neitsyt on Meksikon kansallispyhimys, joka on ilmestynyt meksikolaisille unessa ja jolle on pyhitetty suuri basilika.
1900-luvulla luostari siirtyi fransiskaaniveljeskunnan haltuun.
