Fra 2000 til 2001 ble antall avdelinger i 2. divisjon halvert, mens antall lag ble redusert fra 96 til 56. Derfor var det 37 lag som rykket direkte ned til 3. divisjonsspill i 2001. I tillegg måtte 11 lag spille kvalifisering mot 19 avdelingsvinnere fra 3. divisjon, der ti puljevinnere fikk plass i 2. divisjon 2001.
De 37 lagene som rykket direkte ned var Vålerenga 2 (avdeling 3) og Start 2 (avdeling 4) som rykket ned fordi førstelagene rykket ned fra Eliteserien, lagene fra 9.- til 12.-plass i hver avdeling, pluss de tre dårligste 8.-plassene: Stranda (avdeling 6), Elverum (avdeling 2) og Strømmen (avdeling 1).
De 11 lagene som måtte spille kvalifisering om å beholde plassen var de fem øvrige 8.-plassene pluss seks av sju 7.-plasser (utenom Vålerenga 2 i avdeling 3). Florø i avdeling 5 unngikk kvalifisering som beste 7.-plass.
2. divisjon 2001 ble således bestående av de 40 øvrige lagene fra 2. divisjon 2000, de fire lagene som tapte kvalifisering om opprykk, de ti lagene som vant kvalifisering om å unngå nedrykk, pluss Strindheim og Eik-Tønsberg som rykket ned fra 1. divisjon 2000.