Ze trouwde in 1543 met Filips II van Spanje. Het koppel was tweemaal elkaars neef en nicht, zowel langs vaders zijde als langs moeders zijde. Een pauselijke dispensatie hief het kerkelijk verbod op dat rustte op het sluiten van zo'n huwelijk. Op 8 juli 1545 werd hun enig kind Don Carlos geboren. Hij was gehandicapt. Vier dagen na de geboorte van Don Carlos stierf Maria in het kraambed. In die vier dagen leed Maria aan koortsen. Tijdgenoten spraken over ruzies tussen Portugese artsen die Maria warm wilden inwikkelen en Spaanse artsen die Maria juist wilden verkoelen. Maria stierf drie maanden vóór haar 18e verjaardag.
Dit was het eerste huwelijk van Filips II van Spanje. Hij zou nog driemaal hertrouwen.