Marcello Mastroianni werd geboren in Fontana Liri, een klein dorpje in de Apennijnen, maar groeide op in Turijn en Rome. Tijdens de Tweede Wereldoorlog zat Mastroianni gevangen in een nazikamp, maar hij wist te ontsnappen en zich schuil te houden in Venetië.
In 1945 begon hij te werken bij een filmbedrijf en nam hij acteerlessen. In 1947 debuteerde hij met de film I Miserabili (naar Victor Hugo'sLes Misérables). Al snel werd hij internationaal bekend. Hij was onder andere te zien in I soliti ignoti (1958) en La dolce vita (1960) van Federico Fellini, waarin hij naast Anita Ekberg speelde. Ook was hij te zien in de film 8½.
Mastroianni werd drie keer genomineerd voor een Oscar voor beste acteur, in 1963, 1978 en 1988.
Mastroianni overleed op 72-jarige leeftijd aan alvleesklierkanker. Zowel Catherine Deneuve als Chiara Mastroianni alsook zijn laatste vriendin Anna Maria Tatò waren bij het sterfbed van Mastroianni aanwezig.