Főként televíziós sorozatokból ismert: 2000 és 2005 között a Szívek szállodája epizódjaiban szerepelt. 2005-től 2020-ig Sam Winchestert alakította az Odaát című misztikus drámasorozatban, mely leghíresebb szerepe lett.
A texasiSan Antonióban született, Sherri Padalecki középiskolai angoltanárnő és Gerald Padalecki fiaként. Apai nagyapja lengyel volt. Van egy bátyja, Jeff és egy húga, Megan. Tizenkét évesen kezdett színészkedni.
A San Antonió-i James Madison High Schoolba járt. 1999-ben megnyerte a Fox Claim to Fame Contest díját, ezután a Teen Choice Awardson tűnt fel, ahol megismerte akkori menedzserét. Az érettségi után, 2000-ben Los Angelesbe költözött, hogy színészi karrierjét építse. Eredetileg a texasi egyetemre akart jelentkezni.
Első szerepét 1999-ben kapta az A Little Inside című filmben. 2000-ben kiválasztották Dean Forester szerepére a Szívek szállodája című sorozatban, melyben 2005-ig szerepelt. A 2000-es évek elején néhány televíziós filmben szerepelt: Silent Witness (2000), Close to Home (2001), Delfinbarátok (2002) és Young MacGyver (2003).
2007-ben a Room 401 című rejtett kamerás műsor házigazdája volt. 2008-ban a Karácsonyi fények, 2009-ben a Péntek 13. szereplője volt.
Magánélete
Los Angelesben élt, de ideje nagy részét Vancouverben töltötte az Odaát forgatása miatt. Padalecki és barátnője, Sandra McCoy 2008 tavaszán eljegyezték egymást. Néhány hónappal később az eljegyzést felbontották, ismeretlen okból.
Szoros barátságot ápol Chad Michael Murray-vel, akivel a Viasztestek és a Szívek szállodája szereplői voltak, valamint az Odaát-beli fivérét alakító Jensen Ackles-vel.
Az Odaát forgatásán ismerkedett meg Genevieve Cortese színésznővel, aki egy démont alakított a sorozatban. 2010. február 27-én házasodtak össze. Első fiuk, Thomas Colton Padalecki 2012. március 19-én, Seattle-ben született. Második fiuk, Austin Sheperd Padalecki 2013. december 22-én jött világra. Harmadik gyermekük, egy Odette Elliott Padalecki nevű lány 2017. március 17-én született.
