Gráfica de Eadie-Hofstee

Representación de Eadie–Hofstee de v fronte a v/a dos datos de cinética encimática de Michaelis–Menten.

En bioquímica, unha gráfica de Eadie–Hofstee ou representación de Eadie–Hofstee é unha representación gráfica de datos de cinética encimática de encimas que seguen a ecuación de Michaelis–Menten. Tamén se lle ten chamado gráfica de Eadie, gráfica de Hofstee e gráfica de Augustinsson. A atribución desta representación gráfica a Woolf adoita omitirse porque, aínda que Haldane e Stern^[1] atribúen a Woolf a elaboración da ecuación subxacente, esta era simplemente unha das tres transformacións liñais da ecuación de Michaelis–Menten que eles introduciran inicialmente. Porén, Haldane indicou en 1957 que Woolf atopara verdadeiramente as tres formas liñais:^[2]

En 1932, o Dr. Kurt Stern publicou unha tradución en alemán do meu libro Enzymes, con numerosas adicións ao texto inglés. Nas pp. 119–120, eu describía algúns métodos gráficos, afirmando que estes se debían ao meu amigo o Dr. Barnett Woolf. [...] Woolf sinalou que as gráficas liñais se obtiñan cando ${\displaystyle v}$ se representa fronte a ${\displaystyle vx^{-1}}$, ${\displaystyle v^{-1}}$ fronte a ${\displaystyle x^{-1}}$, ou ${\displaystyle v^{-1}x}$ fronte a ${\displaystyle x}$, sendo a primeira gráfica a máis conveniente a non ser que se estea estudando a inhibición.

Derivación da ecuación para a gráfica

A ecuación máis simple para a velocidade ${\displaystyle v}$ dunha reacción catalizada por un encima en función da concentración de substrato ${\displaystyle a}$ é a ecuación de Michaelis-Menten, que é a seguinte:

${\displaystyle v={{Va} \over {K_{\mathrm {m} }+a}}}$

na cal ${\displaystyle V}$ é a velocidade con saturación do substrato (cando ${\displaystyle a}$ se aproxima ao infinito) ou velocidade limitante, e ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$ é o valor de ${\displaystyle a}$ a media saturación, é dicir, para ${\displaystyle v=0,5V}$, o que se coñece como constante de Michaelis. Eadie^[3] e Hofstee^[4] transformárona nunha relación liñal (representada cunha recta). A multiplicación de ambos os membros da ecuación por ${\displaystyle {{K_{\mathrm {m} }+a} \over {a}}}$ dá lugar a:

${\displaystyle K_{\mathrm {m} }\cdot {v \over a}+v=V}$

Con isto pode operarse para obter unha relación liñal:

${\displaystyle v=V-K_{\mathrm {m} }\cdot {v \over a}}$

o cal mostra que unha representción gráfica de ${\displaystyle v}$ fronte a ${\displaystyle v/a}$ é unha liña recta que corta en ${\displaystyle V}$ no eixe de ordenadas, e ten unha pendente de ${\displaystyle -K_{\mathrm {m} }}$ (gráfica de Hofstee).

Na gráfica de Eadie os eixes de coordenadas están invertidos:

${\displaystyle {v \over a}={V \over K_{\mathrm {m} }}-{1 \over K_{\mathrm {m} }}\cdot v}$

e hai un punto de corte en ${\displaystyle V \over K_{\mathrm {m} }}$ nas ordenadas e a pendente é ${\displaystyle -{1 \over K_{\mathrm {m} }}}$.

Estas gráficas son versións cinéticas da gráfica de Scatchard usada en experimentos de unión de ligandos.

Atribución a Augustinsson

A gráfica atribúese algunhas veces a Augustinsson^[5] e denomínase gráfica de Woolf–Augustinsson–Hofstee^[6][7][8] ou simplemente gráfica de Augustinsson.^[9] Porén, aínda que Haldane, Woolf ou Eadie non foron citados explicitamente cando Augustinsson presentou a ecuación de ${\displaystyle v}$ fronte a ${\displaystyle v/a}$, os traballos de Haldane^[10] e Eadie^[3] son citados noutras partes do seu traballo e aparecen na súa bibliografía.^{[5]:169 e 171}

Efecto sobre os erros experimentais

O erro experimental considérase xeralmente que afecta a velocidade ${\displaystyle v}$ e non a concentrción de substrato ${\displaystyle a}$, así que ${\displaystyle v}$ é a variable dependente.^[11] Como resultado, tanto a ordenada ${\displaystyle v}$ coma a abscisa ${\displaystyle v/a}$ están suxeitas a erro experimental, e as deviacións que ocorren debido ao erro non son paralelas ao eixe de ordenadas senón cara á orixe ou lonxe da orixe. Con tal de que a gráfica se use para ilustrar unha análise en lugar de para estimar os parámetros, isto non importa moito. Malia estas considercións, varios autores^[12][13][14] compararon a adecuación de varias gráficas para presentar análises de datos.

Uso para a estimación de parámetros

Igual que outras representacións gráficas liñais da ecuación de Michaelis–Menten, a de Eadie–Hofstee foi usada historicamente para facer unha avaliación rápida dos parámetros ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$ e ${\displaystyle V}$, pero foi en gran medida substituída polos métodos de regresión non-liñal que son significativamente máis exactos cando se ponderan axeitadamente e xa non son computacionalmenrte inaccesibles.

Posta en evidencia de fallos no deseño experimental

Recoñecemento dun mal deseño experimental en gráficos de Eadie–Hofstee cando a maioría dos valores de ${\displaystyle a}$ son demasiado grandes (esquerda) ou demasiado pequenos (dereita).

A medida que a escala no eixe de odenadas abrangue todo o rango de valores teoricamente posibles de ${\displaystyle v}$, desde ${\displaystyle 0}$ a ${\displaystyle V}$, pode verse dunha soa ollada nun gráfico de Eadie–Hofstee o ben que un deseño experimental enche o espazo de deseño teórico, e a gráfica fai imposible agochar un mal deseño. Ao contrario, as outras ben coñecidas representacións gráficas liñais fan que sexa doado escoller escalas que suxiran que o deseño é mellor do que realmente é. O deseño defectuoso, como se mostra no diagrama da dereita, é común en experimentos cun substrato que non é dabondo soluble ou é demasiado caro para usar concentracións por riba da ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$, e neste caso ${\displaystyle V/K_{\mathrm {m} }}$ non se pode estimar satisfactoriamente. O caso oposto, con valores de ${\displaystyle a}$ concentrados por riba da ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$ (diagrama da esquerda), é menos común pero non descoñecido, como por exemplo nun estudo da nitrato redutase.^[15]

Notas

1. Haldane, John Burdon Sanderson; Stern, Kurt Günter (1932). Allgemeine Chemie der Enzyme. Wissenschaftliche Forschungsberichte, Naturwissenschaftliche Reihe, herausgegeben von Dr. Raphael Eduard Liesegang 28. Dresden and Leipzig: Theodor Steinkopff. pp. 119–120. OCLC 964209806. 
2. Haldane JB (1957). "Graphical Methods in Enzyme Chemistry". Nature (en inglés) 179 (4564): 832. Bibcode:1957Natur.179R.832H. ISSN 1476-4687. doi:10.1038/179832b0. 
3. Eadie GS (1942). "The Inhibition of Cholinesterase by Physostigmine and Prostigmine". Journal of Biological Chemistry 146: 85–93. doi:10.1016/S0021-9258(18)72452-6. 
4. Hofstee BH (outubro de 1959). "Non-inverted versus inverted plots in enzyme kinetics". Nature 184 (4695): 1296–1298. Bibcode:1959Natur.184.1296H. PMID 14402470. doi:10.1038/1841296b0. 
5. Augustinsson KB (1948). "Cholinesterases: A study in comparative enzymology.". Acta Physiologica Scandinavica 15: Supp. 52. 
6. Kobayashi H, Take K, Wada A, Izumi F, Magnoni MS (xuño de 1984). "Angiotensin-converting enzyme activity is reduced in brain microvessels of spontaneously hypertensive rats". Journal of Neurochemistry 42 (6): 1655–1658. PMID 6327909. doi:10.1111/j.1471-4159.1984.tb12756.x. 
7. Barnard JA, Ghishan FK, Wilson FA (marzo de 1985). "Ontogenesis of taurocholate transport by rat ileal brush border membrane vesicles". The Journal of Clinical Investigation 75 (3): 869–873. PMC 423617. PMID 2579978. doi:10.1172/JCI111785. 
8. Quamme GA, Freeman HJ (xullo de 1987). "Evidence for a high-affinity sodium-dependent D-glucose transport system in the kidney". The American Journal of Physiology 253 (1 Pt 2): F151–F157. PMID 3605346. doi:10.1152/ajprenal.1987.253.1.F151. 
9. Dombi GW (outubro de 1992). "Limitations of Augustinsson plots". Computer Applications in the Biosciences 8 (5): 475–479. PMID 1422881. doi:10.1093/bioinformatics/8.5.475. 
10. Haldane JB (1930). Plimmer RH, Hopkins FG, eds. Enzymes. Londres, Nova York: Longmans, Green, & Company. OCLC 615665842. 
11. Isto é probablemente certo, polo meno aproximadamente, aínda que probablemetne é demasiado optimista pensar que ${\displaystyle a}$ se coñece exactamente.
12. Dowd JE, Riggs DS (febreiro de 1965). "A comparison of estimates of Michaelis-Menten kinetic constants from various linear transformations.". The Journal of Biological Chemistry 240 (2): 863–869. PMID 14275146. doi:10.1016/S0021-9258(17)45254-9. 
13. Atkins GL, Nimmo IA (setembro de 1975). "A comparison of seven methods for fitting the Michaelis-Menten equation". The Biochemical Journal 149 (3): 775–777. PMC 1165686. PMID 1201002. doi:10.1042/bj1490775. 
14. Cornish-Bowden A (27 de febreiro de 2012). Fundamentals of Enzyme Kinetics (4ª ed.). Weinheim, Germany: Wiley-Blackwell. pp. 51–53. ISBN 978-3-527-33074-4. 
15. Buc, J.; Santini, C. L.; Blasco, F.; Giordani, R.; Cárdenas, M. L.; Chippaux, M.; Cornish-Bowden, A.; Giordano, G. (1995). "Kinetic studies of a soluble αβ complex of nitrate reductase A from Escherichia coli: Use of various αβ mutants with altered β subunits". Eur. J. Biochem. 234 (3): 766–772. doi:10.1111/j.1432-1033.1995.766_a.x. 

Véxase tamén

Outros artigos

• Cinética de Michaelis–Menten
• Gráfica de Lineweaver–Burk
• Gráfica de Hanes–Woolf
• Gráfica liñal directa