Cinética encimática

A dihidrofolato redutase de E. coli cos seus dous substratos: dihidrofolato (dereita) e NADPH (esquerda), unidos no sitio activo. A proteína móstrase como un diagrama de fitas, coas hélices alfa en vermello, as follas beta en amarelo e os bucles en azul. (PDB 7DFR)

A cinética encimática é o estudo das velocidades de reaccións químicas catalizadas por encimas. Na cinética encimática, mídese a velocidade de reacción e investíganse os efectos de variar as condicións da reacción. Estudar a cinética dun encima desta maneira pode revelar o mecanismo catalítico dese encima, o seu papel no metabolismo, como se controla a súa actividade, e como un fármaco ou un modificador (inhibidor ou activador) poderían afectar a velocidade.

Un encima (E) é unha proteína que funciona como catalizador biolóxico para facilitar e acelerar unha reacción química no corpo. Faino ao unirse a outra molécula, o seu substrato (S), sobre o cal actúa o encima para formar o produto desexado. O substraro únese ao sitio activo do encima para formar o complexo encima-substrato ES, e transfórmase no complexo encima-produto EP e a partir del fórmase o produto P, a través dun estado de transición ES*. Esta serie de pasos coñécese como mecanismo da catálise:

E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P

Este exemplo é o caso máis simple dunha reacción cun só substrato e un só produto. Tales casos existen: por exemplo, unha mutase como a fosfoglicomutase cataliza a transferencia dun grupo fosfato desde unha posición a outra; este encima pertence ao grupo das isomerases, que é un termo máis xeral para un encima que cataliza calquera reacción de isomerización cun substrato e un produto, como a triosa-fosfato isomerase. Porén, ditos encimas non son moi comúns, e son moi superados en número por encimas que catalizan reaccións con dous substratos e dous produtos; entre estes están, por exemplo, as deshidroxenases dependentes de NAD⁺ como a alcohol deshidroxenase, a cal cataliza a oxidación de etanol polo NAD⁺. As reaccións con tres ou catro substratos ou produtos son menos comúns, pero tamén hai casos. Non é necesario que o número de produtos sexa igual ao de substratos; por exemplo, a gliceraldehido 3-fosfato deshidroxenase ten tres substratos e dous produtos.

Cando os encimas se unen a múltiples substratos, como a dihidrofolato redutase (mostrada á dereita), a cinética encimática pode tamén mostrar a secuencia na cal se liberan os produtos. Un exemplo de encimas que se unen a un só substrato e liberan múltiples produtos son as proteases, que dividen un substrato proteíco en dous produtos polipeptídicos. Outros únense a dous substratos á vez, como a ADN polimerase que enlaza nucleótidos ao ADN. Aínda que estes mecanismos constan a miúdo de series complexas de pasos, hai normalmente un paso que determina a velocidade (limitante) do que depende a cinética global. Este paso limitante da velocidade pode ser unha reacción química ou un cambio conformacional do encima ou os substratos, como os implicados na liberación de produto(s) do encima.

O coñecemento da estrutura do encima é útil para interpretar os datos cinéticos. Por exemplo, a estrutura pode suxerir como se unen os substratos e produtos durante a catálise; que cambios ocorren durante a reacción; e mesmo o papel exercido por determinados residuos de aminoácidos no mecanismo. Algúns encimas cambian de forma significativamente durante o mecanismo; en tales casos, é útil deteminar a estrutura do encima con e sen análogos do substrato unidos que non experimentan a reacción encimática.

Non todos os catalizadores biolóxicos son encimas proteicos, xa que existen tamén catalizadores baseados no ARN como os ribocimas e os ribosomas, que son esenciais en moitas funcións celulares, como o empalme de ARN e a tradución de proteínas. A principal diferenza entre os ribocimas e os encimas é que os catalizadores de ARN están compostos por nucleótidos, mentres que os encimas están compostos de aminoácidos. Os ribocimas tamén realizan un conxunto máis limitado de reaccións, aínda que os seus mecanismos de reacción e cinética poden analizarse e clasificarse polos mesmos métodos.

Principios xerais

A medida que se engaden maiores cantidades de substrato á reacción, os sitios de unión de moléculas dispoñibles do encima quedan cheos, e chégase a un límite chamado ${\displaystyle V_{\max }}$. Alén dese límite o encima está saturado de substrato e a velocidade da reacción xa non pode incrementarse.

A reacción catalizada por un encima usa exactamente os mesmos reactivos e produce exactamente os mesmos produtos que esa mesma reacción non catalizada. Igual que outros catalizadores, os encimas non alteran o punto de equilibrio entre substratos e produtos.^[1] Porén, a diferenza de reaccións químicas catalizadas, as reaccións catalizadas por encimas mostran cinéticas de saturación. Para unha concentración dada de encima e para concentracións relativamente baixas de substrato, a velocidade de reacción increméntase liñalmente coa concentración de substrato; as moléculas de encima están en gran parte libres para poder catalizar a reacción, e incrementar a concentración de substrato significa aumentar a velocidade á que as moléculas de encima e as de substrato se encontran unhas con outras. Porén, a concentracións de substrato relativamente altas, a velocidade de racción aproxímase asintoticamente ao máximo teórico; os sitios activos do encima están case todos ocupados por moléculas de substrato, o que resulta na saturación, e a velocidade da reacción está determinada pola velocidade de recambio intrínseca do encima.^[2] A concentración de substrato que están no punto medio entre estes dous casos limtantes extremos denótase como K_M. Deste xeito, K_M é a concentración de substrato á cal a velocidade da reacción é a metde da velocidade máxima.^[2]

As dúas propiedades importantes da cinética encimática son a facilidade coa cal o encima pode ser saturado cun substrato, e a velocidade máxima que pode acadar. Coñecer estas propiedades indica o que un encima podería facer na célula e pode mostrar como respondería o encima aos cambios desas condicións.

Ensaios encimáticos

Curva do progreso dunha reacción encimática. A pendente no período de velocidade inicial é a velocidade inicial de reacción v. A ecuación de Michaelis–Menten describe como esta pendente varía coa concentración de substrato.

Os ensaios encimáticos son procedementos de laboratorio que miden a velocidade das reaccións encimáticas. Como os encimas non se consomen nas reaccións que catalizan, os ensaios encimáticos xeralmente seguen os cambios na concentración dos substratos ou dos produtos para medir a velocidade da reacción. Hai moitos métodos de medida. Os ensaios espectofotométricos observan o cambio na absorbancia de luz entre produtos e reactivos; os ensaios radiométricos implican a incorporación ou liberación de radioactividade para medir a cantidade de produto feito co paso do tempo. Os ensaios espectrofotométricos son os máis convenientes porque permiten medir a velocidade de reacción de forma continua. Aínda que para facer os ensaios radiométricos cómpre retirar e contar as mostras (é dicir, son ensaios descontinuos) adoitan ser extremadamente sensibles e poden medir niveis moi baixos de actividade encimática.^[3] Unha estratexia análoga é usar a espectroscopia de masas para monitorizar a incorporación ou liberación de isótopos estables a medida que o substrato é convertido en produto.

Os ensaios de encimas máis sensibles usan láseres enfocados cun microscopio para observar cambios nunha soa molécula de encima a medida que cataliza a súa reacción. Estas medidas poden usar os cambios na fluorescencia de cofactores durante o mecanismo de reacción dun encima, ou de marcadores fluorescentes engadidos a sitios específicos da proteína para informar dos movementos que ocorren durante a catálise.^[4] Estes estudos proporcionan unha nova perspectiva da cinética e dinámica dunha soa molécula de encima, o que se diferenza da cinética tradicional, que observa o comportamento medio de poboacións de millóns de moléculas dun encima.^[5][6]

Un exemplo de curva de progreso da reacción para un ensaio encimático é a que se mostra arriba. O encima produce o produto a unha velocidade inicial que é aproximadamente liñal durante un curto período de tempo desde o comezo da reacción. A medida que a reacción avanza e se vai consumindo o substrato, a velocidade decrece continuamente (con tal de que o substrato non estea xa a niveis de saturación). Para medir a velocidade inicial (e a máxima) os ensaios encimáticos lévanse normalmente a cabo mentres a reacción avanzou só unha pequena porcentaxe antes de completarse totalmente. A lonxitude do período de velocidade inicial depende das condicións do ensaio e pode estar dentro dun rango de milisegundos ou horas. Porén, o equipamento necesario para mesturar líquidos rapidamente permite medidas cinéticas rápidas a velocidades iniciais de menos dun segundo.^[7] Estes ensaios moi rápidos son esenciais para medir a cinética pre-estado estacionario, que se explican máis abaixo.

A maioría dos estudos de cinéticas encimáticas concéntranse nesta parte inicial e aproximadamente liñal das reaccións encimáticas. Porén, tamén é posible medir a curva de reacción completa e axustar estes datos a unha ecuación de velocidade non liñal. Este xeito de medirmos as reaccións encimáticas chámase análise de curva de progreso da reacción.^[8] Este método é útil como alternativa á cinética rápida cando a velocidade inicial é demasiado rápida para medila con precisión.

As directrices dos estándares para o informe de datos encimolóxicos ou STRENDA (do inglés Standards for Reporting Enzymology Data) proporcionan a información mínima necesaria para informar de forma completa de datos cinéticos e de equilibrio de investigacións sobre actividades de encimas, incluíndo as condicións experimentais correspondentes. As directrices foron desenvolvidas para informar de datos de encimas funcionais con rigor e robustez.

Reaccións dun só substrato

Entre os encimas con mecanismos nos que intervén un só substrato están as isomerases como as triosa-fosfato isomerase ou a bisfosfoglicerato mutase, liases intramoleculares como a adenilato ciclase e o ribocima cabeza de martelo, e a ARN liase.^[9] Porén, algúns encimas que só teñen un só substrato non entran dentro desta categoría de mechanismo. A catalase é un exemplo disto, xa que o encima reacciona cunha primeira molécula do substrato peróxido de hidróxeno, queda oxidado e é despois reducido por unha segunda molécula de substrato. Aínda que está implicado un só substrato, a existencia dun intermediario encimático modificado significa que o mecanismo da catalase é realmente un mecanismo pimpón, un tipo de mecanismo que é explicado nas reaccións multisubstrato da sección de máis abaixo.

Cinética de Michaelis–Menten

Un mecanismo de reacción química con ou sen catálise encimática. O encima (E) únese ao substrato (S) para producir o produto (P).

Unha curva de saturación para unha reacción encimática que mostra a relación entre a concentración de substrato e a velocidade de reacción.

Artigo principal: Cinética de Michaelis–Menten.

As reaccións catalizadas por encimas son saturables, a súa velocidade de catálise non mostra unha reposta liñal ao incremento de substrato. Se a velocidade inicial da reacción se mide nun rango de concentracións de substrato (denotadas como [S]), a velocidade de reacción inicial (${\displaystyle v_{0}}$) aumenta a medida que se incrementa a [S], como se mostra á dereita. Porén, a medida que [S] se fai máis alta, o encima faise saturado de substrato e a velocidade inicial chega a V_max, a velocidade máxima do encima.

O modelo cinético de Michaelis–Menten para reaccións cun só substrato móstrase á dereita. Hai unha reacción bimolecular inicial entre o encima E e o substrato S para formar o complexo encima–substrato ES. A velocidade dunha reacción encimática increméntase co aumento da concentración de substrato ata un certo nivel chamado V_max; á V_max, o incremento na concentración de substrato non causa ningún incremento na velocidade da reacción, xa que non hai dispoñible máis encima (E) para que reaccione co substato (S). Aquí, a velocidade da reacción faise independente do complexo ES e a reacción convértese nunha reacción unimolecular de orde cero. Aínda que o mecanismo encimático da reacción unimolecular ${\displaystyle {\ce {ES -> [k_{cat}] E + P}}}$ pode ser bastante complexo, hai normalmente un paso limitante da velocidade que permite modelar esta reacción como un só paso catalítico cunha velocidade unimolecular aparente constante k_cat. Se a reacción procede a través dun ou varios intermediarios, k_cat será unha función de varias constantes de velocidade elementais, mentres que no caso máis simple dunha soa reacción elemental (por exemplo, sen intermediarios) será idéntica á constante de velocidade unimolecular elemental k₂. A constante de velocidade unimolecular aparente k_cat tamén se chama número de recambio ou renovación, e indica o número máximo de reaccións encimáticas catalizadas por segundo.

A ecuación de Michaelis–Menten^[10] describe como a velocidade de reacción (inicial) v₀ depende da posición do equilibrio na unión do substrato e a constante de velocidade k₂.

${\displaystyle v_{0}={\frac {V_{\max }[{\ce {S}}]}{K_{M}+[{\ce {S}}]}}}$    (ecuación de Michaelis–Menten)

coas constantes

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx K_{D}\\V_{\max }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ k_{cat}{\ce {[E]}}_{tot}\end{aligned}}}$

Esta ecuación de Michaelis–Menten é a base da maioría das cinéticas de encimas cun só substrato. Dous supostos esenciais que subxacen nesta ecuación (á parte do suposto xeral sobre o mecanismo que só implica que non hai intermediario ou inhibición do produto, e non hai alostericidade ou cooperatividade). A primeira suposición é a chamada suposición do estado case estacionario (ou hipótese do estado pseudoestacionario), concretamente que a concentración do encima unido ao substrato (e, polo tanto, tamén do encima non unido) cambia moito máis de vagar que a do produto e substrato e así o cambio co paso do tempo do complexo pode ser establecida en cero ${\displaystyle d{\ce {[ES]}}/{dt}\;{\overset {!}{=}}\;0}$. O segundo suposto é que a concentración de encima total non cambia co tempo, así ${\displaystyle {\ce {[E]}}_{\text{tot}}={\ce {[E]}}+{\ce {[ES]}}\;{\overset {!}{=}}\;{\text{const}}}$.

A constante de Michaelis K_M é experimentalmente definida como a concentración á cal a velocidade da reacción encimática é a metade da V_max, o cal pode verificarse substituíndo [S] = K_M na ecuación de Michaelis–Menten e pode tamén verse graficamente. Se o paso encimático limitante da velocidade é lento comparado coa disociación do substrato (${\displaystyle k_{2}\ll k_{-1}}$), a constante de Michaelis K_M é aproximadamente a constante de disociación K_D do complexo ES.

Se ${\displaystyle {\ce {[S]}}}$ é pequena comparada coa ${\displaystyle K_{M}}$, entón o termo ${\displaystyle [{\ce {S}}]/(K_{M}+[{\ce {S}}])\approx [{\ce {S}}]/K_{M}}$ e tamén se forma moi pouco complexo ES, así ${\displaystyle {\ce {[E]_{\rm {tot}}\approx [E]}}}$. Polo tanto, a velocidade de formación do produto é

${\displaystyle v_{0}\approx {\frac {k_{cat}}{K_{M}}}{\ce {[E][S]}}\qquad \qquad {\text{se }}[{\ce {S}}]\ll K_{M}}$

Deste modo, a velocidade de formación do produto depende da concentración do encima así como da de substato, a ecuación lembra unha reacción bimolecular cunha constante de velocidade de pseudosegunda orde correspondente ${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$. Esta constante é unha medida da eficiencia catalítica. Os encimas máis eficientes acadan unha ${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$ no rango de 10⁸ – 10¹⁰ M⁻¹ s⁻¹. Eses encimas son tan eficientes que catalizan a reacción cada vez que se encontran cunha molécula de substrato e chegan así un límite teórico superior para a eficiencia (límite de difusión); e denomínanse ás veces encimas cineticamente perfectos.^[11] Pero a maioría dos encimas están lonxe de ser perfectos: os valores medios de ${\displaystyle k_{2}/K_{\rm {M}}}$ e ${\displaystyle k_{2}}$ son de aproximadamente ${\displaystyle 10^{5}{\rm {s}}^{-1}{\rm {M}}^{-1}}$ e ${\displaystyle 10{\rm {s}}^{-1}}$, respectivamente.^[12]

Uso directo da ecuación de Michaelis–Menten para a análise cinética co paso do tempo

As velocidades observadas preditas pola ecuación de Michaelis–Menten poden ser utilizadas para modelizar directamente a desaparición do substrato no curso do tempo e a produción de produto pola incorporación da ecuación de Michaelis–Menten na ecuación de cinética química de primeira orde. Con todo, isto só pode conseguirse se se recoñece o problema asociado co uso do número de Euler na descrición da cinética química de primeira orde, é dicir, e^−k é unha constante dividida que introduce un erro sistemático en cálculos e pode reescribirse como unha soa constante que representa o substrato restante que queda despois de cada período de tempo.^[13]

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-k)^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-v/[S]_{0})^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-(V_{\max }[S]_{0}/(K_{M}+[S]_{0})/[S]_{0}))^{t}\,}$

En 1983 Stuart Beal (e tamén independentemente Santiago Schnell e Claudio Mendoza en 1997) derivaron unha forma pechada de solución para a análise cinética no curso do tempo do mecanismo de Michaelis-Menten.^[14][15] A solución, coñecida como a ecuación de Schnell-Mendoza, ten a seguinte forma:

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]\,}$

onde W[ ] é a función W de Lambert.^[16][17] e onde F(t) é

${\displaystyle F(t)={\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}\exp \!\left({\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}-{\frac {V_{\max }}{K_{M}}}\,t\right)\,}$

Esta ecuación está incluída na ecuación de abaixo, obtida por Berberan-Santos,^[18] a cal é tamén válida cando a concentración inicial de substrato é próxima á do encima,

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]-{\frac {V_{\max }}{k_{cat}K_{M}}}\ {\frac {W\left[F(t)\right]}{1+W\left[F(t)\right]}}\,}$

onde W[ ] é outra vez a función W de Lambert.

Gráficas liñais da ecuación de Michaelis–Menten

Véxase tamén: Gráfica de Lineweaver–Burk, Gráfica de Eadie–Hofstee e Gráfica de Hanes–Woolf.

Unha gráfica de Lineweaver–Burk ou dobre recíproca dos datos cinéticos que mostra a significatividade dos puntos de corte co eixe e o gradiente.

O gráfico de v fronte a [S] de ariba non é liñal; aínda que é inicialmente liñal a baixa [S], cúrvase ata saturarse a alta [S]. Antes da era moderna do axuste de curvas non-liñais con computadores, esta non-liñalidade podía facer que fose difícil estimar a K_M e a V_max con precisión. Polo tanto, varios investigadores desenvolveron liñalizacións da ecuación de Michaelis–Menten, como a representación de Lineweaver–Burk, a de Eadie–Hofstee e a de Hanes–Woolf. Todas estas representacións liñais poden ser útiles para visualizarmos os datos, pero ningunha debería usarse para determinar os parámetros cinéticos, xa hai software informático que está facilmente dispoñible e permite unha determinación máis exacta polos métodos de regresión non-liñal.^[19]

A gráfica de Lineweaver–Burk ou da dobre recíproca é unha forma común de ilustrar os daos cinéticos encimáticos. Orixínase ao tomar a recíproca de ambos os membros da ecuación de Michaelis–Menten. Como se mostra á dereita, isto é unha forma liñal da ecuación de Michaelis–Menten e produce unha liña recta coa ecuación y = mx + c cun punto de corte en Y equivalente a 1/V_max e un punto de corte en X que representa −1/K_M.

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{M}}{V_{\max }[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\max }}}}$

Naturalmente, non se pode tomar ningún valor experimental con valores negativos de 1/[S]; o valor limitante baixo 1/[S] = 0 (o punto de corte en Y) corresponde a unha concentración de substrato infinita, onde 1/v=1/V_max como se ve á dereita; así, o punto de corte en X é unha extrapolación dos dtos experimentais tomados a concentracións positivas. Máis xeralmente, a representación de Lineweaver–Burk distorsiona a importancia das medidas tomadas a concentracións baixas de substrato e, deste xeito, pode producir estimacións inexactas de V_max e K_M.^[20] Un método de representación gráfica liñal máis exacto é a gráfica de Eadie–Hofstee. Neste caso, v represéntase fronte a v/[S]. Na terceira representación liñal común, a gráfica de Hanes–Woolf, [S]/v represéntase fronte a [S]. En xeral, a normalización de datos pode axudar a diminuír a cantidade de traballo experimental e pode incrementar a fiabilidade do resultado, e é axeitado tanto para a análise gráfica coma numérica.^[21]

Significado práctico das constantes cinéticas

O estudo da cinética encimática é importante por dúas razóns básicas. Primeiramente, axuda a explicar como funcionan os encimas, e en segundo lugar, axuda a predicir como se comportan os encimas nos organismos vivos. As constantes cinéticas definidas arriba, K_M e V_max, son fundamentais para intentar entender o funcionamento conxunto dos encimas para o control do metabolismo.

Facer estas predicións non é trivial, incluso en sistemas simples. Por exemplo, o oxalacetato fórmase pola acción da malato deshidroxenase na mitocondria. O oxalacetato pode despois ser utilizado pola citrato sintase, a fosfoenolpiruvato carboxiquinase ou a aspartato aminotransferase, alimentando o ciclo do ácido cítrico, a gliconeoxénese ou a biosíntese de ácido aspártico, respectivamente. Poder predicir a cantidade de oxalacetato que vai parar a cada ruta cómpre coñecer a concentración do oxalacetato, así como a concentración e cinética de cada un destes encimas. Este obxectivo de predicir o comportamento de rutas metabólicas chega á súa expresión máis complexa na síntese de grandes cantidades de datos cinéticos e de expresión xénica en modelos matemáticos de organismos enteiros. Alternativamente, unha simplificación útil do problema da modelización metabólica é ignorar a cinética encimática subxacente e soamente depender da información sobre a estequiometría das redes de reaccións, unha técnica chamada análise de balance de fluxo.^[22][23]

Cinética de Michaelis–Menten con intermediario

Consideremos o caso máis simple

${\displaystyle {\ce {{E}+S<=>[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+P}}}$

onde existe un complexo co encima e un intermediario, e o intermediario é convertido en produto nun segundo paso. Neste caso temos unha ecuación moi similar^[24]

${\displaystyle v_{0}=k_{cat}{\frac {{\ce {[S] [E]_0}}}{K_{M}^{\prime }+{\ce {[S]}}}}}$

pero as constantes son diferentes

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}^{\prime }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}K_{M}={\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}\cdot {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\\k_{cat}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\dfrac {k_{3}k_{2}}{k_{2}+k_{3}}}\end{aligned}}}$

Obtemos isto para o caso limitante ${\displaystyle k_{3}\gg k_{2}}$, así cando o último paso desde ${\displaystyle {\ce {EI -> E + P}}}$ é moito máis rápido que o paso previo, obtemos de novo a ecuación orixinal. Matematicamente, temos entón ${\displaystyle K_{M}^{\prime }\approx K_{M}}$ e ${\displaystyle k_{cat}\approx k_{2}}$.

Reaccións multisubstrato

As reaccións multisubstrato seguen complexas ecuacións da velocidade que describen como se unen os substratos e en que secuencia. A análise destas reaccións é moito máis simple se a concentración do substrato A se mantén constante e a do substrato B varía. Baixo estas condicións, o encima compórtase como se for un encima cun só substrato e unha gráfica de v fronte a [S] dá lugar a unhas constantes aparentes K_M e V_max para o substrato B. Se se realiza un conxunto destas medidas a diferentes concentracións fixas de A, estes datos poden utilizarse para atopar qué mecanismo de reacción se trata. Para un encima que ten dous substratos A e B e que os converte en dous produtos P e Q, hai dous tipos de mecanismos: complexo ternario e pimpón.

Mecanismos de complexo ternario

O mecanismo do complexo ternario de orde aleatoria para unha reacción encimática. A ruta da reacción móstrase como unha liña e os intermediarios encimáticos que conteñen os substratos A e B ou produtos P e Q está escritos baixo a liña.

Nestes encimas, ambos os substratos únense ao encima ao mesmo tempo para producir un complexo tenario EAB. A orde de unión pode ser aleatoria (nun mecanismo ao chou) ou os substratos poden ter que unirse seguindo unha secuencia particular (nun mecanismo ordenado). Cando se representa nunha gráfica de Lineweaver–Burk un conxunto de curvas de v fronte a [S] (A fixa e B variable) para un encima cun mecanismo de complexo ternario, o conxunto de liñas vanse cortar.

Encimas con mecanismos de complexo ternario son, por exemplo, a glutatión S-transferase,^[25] a dihidrofolato redutase^[26] ou a ADN polimerase.^[27] As seguintes ligazóns mostran animacións curtas dos mecanismos de complexo ternario dos encimas dihidrofolato redutase^[β] e ADN polimerase^[γ].

Mecanismos pimpón

${\displaystyle {\ce {\overset {}{E->[{\ce {A \atop \downarrow }}]EA<=>E^{\ast }P->[{\ce {P \atop \uparrow }}]E^{\ast }->[{\ce {B \atop \downarrow }}]E^{\ast }B<=>EQ->[{\ce {Q \atop \uparrow }}]E}}}}$

Mecanismo pimpón nunha reacción encimática. Os intermediarios conteñen os substratos A e B ou os produtos P e Q.

Como se mostra á dereita, os encimas cun mecanismo pimpón poden existir en dous estados, que son E e a forma quimicamente modificada do encima E*; este encima modificado coñécese como intermediario. En tales mecanismos, únese o substrato A, cambia o encima a E* ao, por exemplo, transferir un grupo químico ao sitio activo, e é despois liberado. Soamente despois de que se libera o primeiro substrato poderá unirse o substrato B e reaccionar co encima modificado, rexenerando a forma E non modificada. Cando se representa coa gráfica de Lineweaver–Burk un conxunto de curvas de v fronte [S] (A fixa, B variable) para un encima con mecanismo pimpón, orixínanse un conxunto de liñas paralelas. Isto chámase gráfica secundaria.

Exemplos de encimas con mecanismos pimpón son: algunhas oxidorredutases como a tiorredoxina peroxidase,^[28] transferases como a acilneuraminato citidililtransferase^[29] e serina proteases como a tripsina e a quimotripsina.^[30] As serina proteases son unha familia moi común e diversa de encimas, incluíndo encimas dixestivos (tripsina, quimotripsina e elastase), varios encimas do cadoiro de coagulación sanguínea e moitos outros. Nestas serina proteases, o intermediario E* é unha especie de acil-encima formado polo ataque dun residuo de serina do sitio activo sobre un enlace peptídico dun substrato proteico. Unha animación curta que mostra o mecanismo da quimotripsina pode verse na seguinte ligazón.^[δ]

Catálise reversible e ecuación de Haldane

Artigo principal: Cinética de Michaelis-Menten reversible.

Os factores externos poden limitar a capacidade dun encima de catalizar unha reacción en ambas as direccións (mentres que a natureza dun catalizador é a de non poder catalizar só nunha dirección, segundo o principio da reversibilidade microscópica). Consideremos o caso dun encima que catliza a reacción en ambas as direccións:

${\displaystyle {\ce {{E}+{S}<=>[k_{1}][k_{-1}]ES<=>[k_{2}][k_{-2}]{E}+{P}}}}$

No estado estacionario, a velocidade inicial da reacción é ${\displaystyle v_{0}={\frac {d\,[{\rm {P}}]}{dt}}={\frac {(k_{1}k_{2}\,[{\rm {S}}]-k_{-1}k_{-2}[{\rm {P}}])[{\rm {E}}]_{0}}{k_{-1}+k_{2}+k_{1}\,[{\rm {S}}]+k_{-2}\,[{\rm {P}}]}}}$

${\displaystyle v_{0}}$ é positiva se a reacción avanza cara a adiante (${\displaystyle S\rightarrow P}$) e negativa se vai cara a atrás.

O equilibrio require que ${\displaystyle v=0}$, o cal ocorre cando ${\displaystyle {\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {k_{1}k_{2}}{k_{-1}k_{-2}}}=K_{\rm {eq}}}$. Isto mostra que a termodinámica forza unha relación entre os valores das catro constantes de velocidade.

Os valores da velocidade máxima cara a adiante e cara a atrás obtidos para ${\displaystyle [{\rm {S}}]\rightarrow \infty }$, ${\displaystyle [{\rm {P}}]=0}$, e ${\displaystyle [{\rm {S}}]=0}$, ${\displaystyle [{\rm {P}}]\rightarrow \infty }$, respectivamente, son ${\displaystyle V_{\rm {max}}^{f}=k_{2}{\rm {[E]}}_{tot}}$ e ${\displaystyle V_{\rm {max}}^{b}=-k_{-1}{\rm {[E]}}_{tot}}$, respectivamente. As súa proporción non é igual á constante de equilibrio, o cal implica que a termodinámica non restrinxe a proporción das velocidades máximas. Isto explica que o encima pode ser un "catalizador moito mellor" (en termos de velocidades máximas) nunha determinada dirección da reacción.^[31]

Tamén se poden derivar as dúas constantes de Michaelis ${\displaystyle K_{M}^{S}=(k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$e ${\displaystyle K_{M}^{P}=(k_{-1}+k_{2})/k_{-2}}$. A ecuación de Haldane é a relación ${\displaystyle K_{\rm {eq}}={\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {V_{\rm {max}}^{f}/K_{M}^{S}}{V_{\rm {max}}^{b}/K_{M}^{P}}}}$.

Polo tanto, a termodinámica restrinxe a proporción entre os valores da reacción cara a adiante e cara a atrás ${\displaystyle V_{\rm {max}}/K_{M}}$, non a proporción dos valores ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$.

Cinética non de Michaelis–Menten

Artigo principal: Regulación alostérica.

Curva de saturación para unha reacción encimática que mostra unha cinética sigmoide.

Hai moitos sistemas encimáticos que non seguen o comportamento de Michaelis-Menten. Uns poucos exemplos seleccionados son a cinética de encimas autocatalíticos, encimas cooperativos e alostéricos, encimas interfaciais e intracelulares, encimas procesivos e moitos outros. Algúns encimas producen unha gráfica sigmoide de v fronte a [S], que adoita indicar unha unión cooperativa do substrato ao sitio activo. Isto significa que a unión dunha molécula de substrato afecta a unión de sucesivas moléculas de substrato. Este comportamento é máis común en encimas multiméricos con varios sitios activos que inteaccionan.^[32] Aquí, o mecanismo de cooperación é similar ao da hemoglobina, no que a unión do substrato a un sitio activo altera a afinidade doutros sitios activos para moléculas de substrato. A cooperatividade positiva ocorre cando a unión da primeira molécula de substrato incrementa a afinidade dos outros sitios activos polo substrato. A cooperatividade negativa prodúcese cando a unión do primeiro substrato diminúe a afinidade do encima por outras moléculas de substrato.

Entre os encimas alostéricos están a tirosil ARNt-sintetase de mamífero, que mostra cooperatividade negativa,^[33] e a aspartato transcarbamoilase bacteriana^[34] e a fosfofrutoquinase,^[35] que mostra cooperatividade positiva.

A cooperatividade é sorprendentemente común e pode contribuír a regular as respostas dos encimas a cambios nas concentracións dos substratos. A cooperatividade positiva fai que os encimas sexan moito máis sensibles á [S] e que as súas actividades poidan mostrar grandes cambios nun estreito intervalo de concentracións de substrato. Inversamente, a cooperatividade negativa fai que os encimas sexan insensibles a pequenos cambios na [S].

A ecuación de Hill^[36] adoita utilizarse para describir o grao de cooperatividade cuantitativamente en cinética non de Michaelis–Menten. O coeficiente de Hill derivado n mide canto afecta a unión dun substrato a un sitio activo a unión do susbtrato a outros sitios activos. Un coeficiente de Hill <1 indica cooperatividade negativa e un coeficiente >1 indica cooperatividade positiva.

Cinética do estado pre-estacionario

Curva do progreso do estado pre-estacionario, mostrando a fase explosiva (burst na imaxe) dunha reacción encimática.

No primeiro momento despois de que un encima se mestura co seu substrato, non se formou aínda produto e non existen intermediarios. O estudo dos seguintes milisegundos da reacción chámase tudo da cinética do estado pre-estacionario. A cinética do estado pre-estacionario trata, pois, da formación e consumo dos intermediarios encima-substrato (como ES ou E*) ata que se chega ás súas concentracións do estado estacionario.

Este procedemento foi aplicado primeiramente á reacción de hidrólise catalizada pola quimotripsina.^[37] Con frecuencia, a detección dun intermediario é unha proba fundamental en investigacións dos mecanismos que segue un encima. Por exemplo, nos mecanismos pimpón que se mostraron máis arriba, poden facerse medidas cinéticas rápidas da liberación do produto P e pódese medir a cinética do intermediario modificado do encima E*.^[38] No caso da quimotripsina, este intermediario fórmase por un ataque ao substrato pola serina nucleófila do sitio activo e a formación do intermediario acil-encima.

Na figura da dereita, o encima produce E* rapidamente nos primeiros poucos segundos da reacción. Despois, a velocidade faise máis lenta a medida que se chega ao estado estacionario. Esta rápida fase explosiva da reacción mide un só recambio ou turnover do encima. En consecuencia, a cantidade de produto liberado nesta explosión de actividade, mostrada como o corte co eixe Y da gráfica, tamén nos dá a cantidade de encima funcional que está presente no ensaio.^[39]

Mecanismo químico

Un importante obxectivo de medir a cinética encimática é determinar o mecanismo químico da reacción encimática, é dicir, a secuencia de pasos químicos que transforman o substrato no produto. Os procedementos cinéticos expostos antes mostran a que velocidade se forman e son interconvertidos os intermediarios, mais non se pode identificar exactamente que intermediarios son.

As medidas cinéticas tomadas en varias condiciókns da solución ou con encimas ou substratos lixeiramente modificados adoitan servir para aclarar cal é o mecanismo químico implicado, xa que revelan o paso limitante da velocidade ou os intermediarios da reacción. Por exemplo, a rotura dun enlace covalente dun átomo de hidróxeno é un paso limitante común. Pode mostrarse cal das posibles transferencias de hidróxeno é limitante da velocidade, medindo os efectos cinéticos de substituír cada hidróxeno por deuterio, o seu isótopo estable. A velocidade cambiará cando se substitúe o hidróxeno que é crítico para esa reacción, debido a un efecto isotópico cinético primario, que ocorre porque os enlaces que establece o deuterio son máis difíciles de romper que os do hidróxeno normal.^[40] Tamén é posible medir efectos similares con outras substitucións isotópicas, como con ¹³C/¹²C e ¹⁸O/¹⁶O, pero estes efectos son máis sutís.^[41]

Os isótopos poden usarse tamén para revelar o destino de variantes da molécula do substrato no produto final. Por exemplo, por veces é difícil a orixe dun átomo de oxíxeno no produto final; xa que pode proceder da auga ou dalgunha parte do susbtrato. Isto pode determinarse substituíndo sistematicamente o isótopo estable do oxíxeno ¹⁸O nas varias moléculas que participan na reacción e comprobando a presenza do isótopo no produto.^[42] O mecanismo químico pode tamén dilucidarse examinando a cinética e os efectos isotópicos en diferentes condicións de pH,^[43] alterando os ións metálicos e outros cofactores unidos,^[44] por medio de mutaxénese dirixida a sitio de residuos de aminoácidos conservados, ou estudando o comportamento do encima en presenza de análogos do substrato.^[45]

Inhibición e activación de encimas

Artigo principal: Inhibición encimática.

Esquema cinético para inhibidores encimáticos reversibles.

Os inhibidores encimáticos son moléculas que reducen ou eliminan a actividade encimática, mentres que os activadores encimáticos son moléculas que incrementan a velocidade catalítica dos encimas. Estas interaccións poden ser reversibles (é dicir, a retirada do inhibidor restaura a actividade encimática) ou irreversibles (é dicir, o inhibidor inactiva permanentemente o encima).

Inhibidores reversibles

Tradicionalmente on inhibidores encimáticos reversibles foron clasificados como competitivos, incompetitivos (acompetitivos), ou non-competitivos, segundo os seus efectos sobre a K_M e a V_max. Estes diferentes efectos resultan da unión do inhibidor ao encima E, ao complexo encima–substrato ES, ou a ambos os dous, respectivamente. A división destas clases orixínase dun problema na súa derivación e da necesidade de usar dúas constantes de unión diferentes para un evento de unión. A unión dun inhibidor e o seu efecto sobre a actividade encimática son dúas cousas claramente diferentes, o que é outro problema que as ecuacións tradicionais non resolven. Na inhibición non-competitiva a unión do inhibidor ten como resultado un 100 % de inhibición do encima só, e non entra a considerar a posibilidade de que haxa algo en medio.^[46] Na inhibición non-competitiva, o inhibidor únese a un encima no seu sitio alostérico; polo tanto, a afinidade de unión, ou inversa de K_M, do substrato co encima permanecerá igual. Por outra parte, a V_max diminuirá en comparación cun encima non inhibido. Nunha gráfica de Lineweaver-Burk, a presenza dun inhibidor non-competitivo ilústrase por un cambio no punto de corte co eixe Y, definido como 1/V_max. O punto de corte co eixe X, definido como −1/K_M, permanece igual. Na inhibición competitiva o inhibidor únese ao encima no sitio activo, competindo co substrato. Como resultado, a K_M aumenta e a V_max queda igual.^[47] A forma común do termo inhibitorio tamén agocha as relacións entre a unión do inhibidor ao encima e as súas relacións con calquera outro termo de unión que haxa na ecuación Michaelis–Menten ou unha curva de resposta á dose asociada coa unión do receptor ao ligando. Para demostrar as relacións pódense facer as seguintes operacións:

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {[I]}{K_{i}}}}}={\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{K_{i}}}}}$

Engadindo cero no denominador ([I]-[I])

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{[I]+K_{i}-[I]}}}}$

Dividindo por [I]+K_i

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {1}{1-{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}}}=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Esta notación demostra que de maneira similar á ecuación de Michaelis–Menten, na cal a velocidade da reacción depende da porcentaxe da poboación de encima que interacción co substrato, o efecto do inhibidor é o resultado da porcentaxe da poboación de encima que interacciona co inhibidor. O único problema con esa ecuación na súa forma actual é que supón unha inhibición absoluta do encima coa unión do inhibidor, cando en realidade podería haber un amplo rango de efectos situados nalgún punto entre o 100 % de inhibición do recambio de substrato e xusto >0 %. Para ter en conta isto, a ecuación pode modificarse doadamente para permitir diferentes graos de inhibición, incluíndo un termo delta V_max.

${\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

ou

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Este termo pode entón definir a actividade encimática residual presente cando o inhibidor interacciona cos encimas individuais da poboación. Porén, a inclusión deste termo ten o valor engadido de permitir a posibilidade de activación se o termo V_max secundaria resulta ser máis alto que o termo inicial. Para ter en conta a posibilidade de activación tamén, a notación pode reescribirse substituíndo o inhibidor "I" cun termo modificador denotado aquí como "X".

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

Aínda que esta terminoloxía resulta nunha forma simplificada de tratar os efectos cinéticos relacionados coa velocidade máxima da ecuación de Michaelis–Menten, serve para salientar os posibles problemas co termo utilizado para describir os efectos relacionados coa K_M. A K_M que se relciona coa afinidade do encima polo substrato debería en moitos casos relacionarse con posibles cambios no sitio de unión do encima que resultría directamente de interaccións entre o inhibidor e o encima. Como un termo similar ao proposto máis arriba para modular V_max debería ser apropiado na maioría das situacións quedaría:^[48]

${\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

Inhibidores irreversibles

Os inhibidores encimáticos poden tamén inactivar irreversiblemente encimas, xeralmente pola modificación covalente de residuos do sitio activo. Estas reaccións, que se poden chamar de substratos suicidas, seguen un decaimento exponencial no seu funcionamento e son usualmente saturables. Por debaixo da saturación, seguen unha cinética de primeira orde con respecto ao inhibidor. A inhibición irreversible pode clasificarse en dous tipos distintos. O etiquetado de afinidade é un tipo de inhibición irreversible onde un grupo funcional que é altamente reactivo modifica un residuo catalítico esencial na proteína de interese para levar a cabo a inhibición. O outro tipo é a inhibición baseada no mecanismo, que implica que a unión do inhibidor vai seguida de alteracións mediadas polo encima que transforma este último nun grupo reactivo que irreversiblemente modifica o encima.

Consideracións sobre a reversibilidade e irreversibilidade da inhibición

Unha vez explicadas as inhibicións reversible e irreversible nos capítulos anteriores, cómpre sinalar que o concepto de irreversibilidade (ou irreversibilidade) é unha construción puramente teórica que depende exclusivamente do marco de tempo do ensaio, é dicir, un ensaio reversible que implica a asociación e disociación da molécula inhibidora en escalas temporais de minutos parecería irreversible se nun ensaio o resultado se toma en segundos e viceversa. Hai un continuo no comportamento do inhibidor que vai desde a reversibilidade á irreversibilidade nun marco de tempo do ensaio non arbitrario. Hai inhibidores que mostran un comportamento de comezo lento e a maioría destes inhibidores, invariablemente, tamén mostran unha unión moi estreita á proteína diana de interese.

Mecanismos da catálise

Artigo principal: Catálise encimática.

A variación de enerxía en función da coordinada de reacción mostra a estabilización do estado de transición dun encima.

O modelo máis utilizado para a interacción encima-substrato é o modelo de axuste inducido.^[49] Este modelo propón que a interaciónn inicial entre o encima e o substrato é relativamente débil, pero que estas interaccións febles inducen rapidamente cambios conformacionais no encima que reforzan a unión. Estes cambios conformacionais tamén achegan os residuos catalíticos do sitio activo ás proximidades dos enlaces químicos do substrato que serán alterados na reacción.^[50] Os cambios conformacionais poden medirse usando o dicroísmo circular ou a interferometría de polarización dual. Unha vez que ten lugar a unión, un ou máis mecanismos de catálise causan a rebaixa da enerxía do estado de transición da reacción proporcionando unha vía química alternativa para a reacción. Entre os mecanismos de catálise están a catálise por tensión no enlace; por proximidade e orientación; por doantes ou aceptode protóns do sitio activo; a catálise covalente e o efecto túnel cuántico.^[38][51]

A cinética encimática non pode probar que modos de catálise usa un encima. Porén, algúns datos cinéticos poden suxerir algunhas posibilidades para examinalas con outras técnicas. Por exemplo, un mecanismo pimpón cunha cinética de estado pre-estacionario de fase explosiva suxeriría que a catálise covalente podería ser importante nese mecanismo encimático. Alternativamente, a observación dun forte efecto do pH sobre a V_max pero non sobre a K_M podería indicar que un residuo do sitio activo necesita estar nun estado determinado de ionización para que poida ter lugar a catálise.

Historia

En 1902 Victor Henri propuxo unha teoría cuantitativa da cinética encimática,^[52] pero daquela aínda non se recoñecera a importanica experimental da concentración do ión hidróxeno. Despois de que Peter Lauritz Sørensen definira a escala logarítmica de pH e introducira o concepto do tamponamento en 1909^[53] o químico alemán Leonor Michaelis e a doutora Maud Leonora Menten (que era unha investigadora de posdoutoramento no laboratorio de Michaelis naquel momento) repetiron os experimentos de Henri e confirmaron a súa ecuación, que xeralmente se denomina agora cinética de Michaelis-Menten (ás veces tamén cinética de Henri-Michaelis-Menten).^[54] O seu traballo continuaron desenvolvéndoo G. E. Briggs e J. B. S. Haldane, que derivaron as ecuacións cinéticas que aínda se consideran xeneralizadamente hoxe como un punto de partida na modelización da actividade encimática.^[55]

A principal contribución do enfoque seguido por Henri-Michaelis-Menten foi entender as reaccións encimáticas en dúas etapas. Na primeira, o substrato únese reversiblemente ao encima, formando o complexo encima substrato. Isto chámase ás veces complexo de Michaelis. O encima despois cataliza o paso químico da reacción e libera o produto. A cinética de moitos encimas descríbese axeitadamente polo modelo simple de Michaelis-Menten, mais todos os encimas teñen movementos internos que o modelo non ten en conta e poden ter contribucións significativas ao conxunto da cinética da reacción. Isto pode ser modelizado introducindo varias vías de Michaelis-Menten que están conectadas con velocidades flutuantes,^[56][57][58] o que é unha ampliación matemática do mecanismo básico de Michaelis-Menten.^[59]

Programas informáticos

ENZO (Enzyme Kinetics) é unha ferramenta de interface gráfico para construír modelos cinéticos de reaccións catalizadas por encimas. ENZO xera automaticamente as correspondentes ecuacións diferenciais a partir dun esquema de reacción encimática estipulado. Estas ecuacións diferenciais son procesadas por un solucionador numérico e un algoritmo de regresión que axusta os coeficientes das ecuacións diferenciais a curvas do curso da reacción co tempo observadas experimentalmente. ENZO permite unha avaliación rápida de esquemas de reacción rivais e pode usarse para tests de rutina en cinética encimática.^[60]

Notas a rodapé

α. ^{^} Ligazón: Titorial interactivo da cinética de Michaelis–Menten (necesario Java)

β. ^{^} Ligazón: Mecanismo da dihidrofolato redutase (Gif)

γ. ^{^} Ligazón: Mecanismo da ADN polimerase (Gif)

δ. ^{^} Ligazón: Mecanismo da quimiotripsina (necesario Flash)

Notas

1. Wrighton MS, Ebbing DD (1993). General chemistry (4ª ed.). Boston: Houghton Mifflin. ISBN 978-0-395-63696-1. 
2. Fromm H.J., Hargrove M.S. (2012) Enzyme Kinetics. In: Essentials of Biochemistry. Springer, Berlin, Heidelberg
3. Danson M, Eisenthal R (2002). Enzyme assays: a practical approach. Oxford [Oxfordshire]: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-963820-8. 
4. Xie XS, Lu HP (xuño de 1999). "Single-molecule enzymology". The Journal of Biological Chemistry 274 (23): 15967–15970. PMID 10347141. doi:10.1074/jbc.274.23.15967. 
5. Lu HP (xuño de 2004). "Single-molecule spectroscopy studies of conformational change dynamics in enzymatic reactions". Current Pharmaceutical Biotechnology 5 (3): 261–269. PMID 15180547. doi:10.2174/1389201043376887. 
6. Schnell JR, Dyson HJ, Wright PE (2004). "Structure, dynamics, and catalytic function of dihydrofolate reductase". Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 33: 119–140. PMID 15139807. doi:10.1146/annurev.biophys.33.110502.133613. 
7. Gibson QH (1969). "[6] Rapid mixing: Stopped flow". Rapid mixing: Stopped flow. Methods in Enzymology 16. pp. 187–228. ISBN 978-0-12-181873-9. doi:10.1016/S0076-6879(69)16009-7. 
8. Duggleby RG (1995). "[3] Analysis of enzyme progress curves by nonlinear regression". Analysis of enzyme progress curves by non-linear regression. Methods in Enzymology 249. pp. 61–90. ISBN 978-0-12-182150-0. PMID 7791628. doi:10.1016/0076-6879(95)49031-0. 
9. Murray JB, Dunham CM, Scott WG (xaneiro de 2002). "A pH-dependent conformational change, rather than the chemical step, appears to be rate-limiting in the hammerhead ribozyme cleavage reaction". Journal of Molecular Biology 315 (2): 121–130. PMID 11779233. doi:10.1006/jmbi.2001.5145. 
10. Michaelis L. and Menten M.L. Kinetik der Invertinwirkung Biochem. Z. 1913; 49:333–369 English translation Consultado o 6 de abril de 2007
11. Stroppolo ME, Falconi M, Caccuri AM, Desideri A (setembro de 2001). "Superefficient enzymes". Cellular and Molecular Life Sciences 58 (10): 1451–1460. PMC 11337273. PMID 11693526. doi:10.1007/PL00000788. 
12. Bar-Even A, Noor E, Savir Y, Liebermeister W, Davidi D, Tawfik DS, Milo R (maio de 2011). "The moderately efficient enzyme: evolutionary and physicochemical trends shaping enzyme parameters". Biochemistry 50 (21): 4402–4410. PMID 21506553. doi:10.1021/bi2002289. 
13. Walsh R, Martin E, Darvesh S (xaneiro de 2010). "A method to describe enzyme-catalyzed reactions by combining steady state and time course enzyme kinetic parameters". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1800 (1): 1–5. PMID 19840832. doi:10.1016/j.bbagen.2009.10.007. 
14. Beal SL (decembro de 1983). "Computation of the explicit solution to the Michaelis-Menten equation". Journal of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics 11 (6): 641–657. PMID 6689584. doi:10.1007/BF01059062. 
15. Schnell S, Mendoza C (1997). "Closed Form Solution for Time-dependent Enzyme Kinetics". Journal of Theoretical Biology 187 (2): 207–212. Bibcode:1997JThBi.187..207S. doi:10.1006/jtbi.1997.0425. 
16. Goudar CT, Sonnad JR, Duggleby RG (xaneiro de 1999). "Parameter estimation using a direct solution of the integrated Michaelis-Menten equation" (PDF). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology 1429 (2): 377–383. PMID 9989222. doi:10.1016/s0167-4838(98)00247-7. Arquivado dende o orixinal (PDF) o 9 de novembro de 2015. 
17. Goudar CT, Harris SK, McInerney MJ, Suflita JM (decembro de 2004). "Progress curve analysis for enzyme and microbial kinetic reactions using explicit solutions based on the Lambert W function". Journal of Microbiological Methods 59 (3): 317–326. PMID 15488275. doi:10.1016/j.mimet.2004.06.013. 
18. Berberan-Santos MN (2010). "A General Treatment of Henri Michaelis Menten Enzyme Kinetics: Exact Series Solution and Approximate Analytical Solutions" (PDF). MATCH Communications in Mathematical and in Computer Chemistry 63: 283. 
19. Jones ME (decembro de 1992). "Analysis of algebraic weighted least-squares estimators for enzyme parameters". The Biochemical Journal. 288 ( Pt 2) (Pt 2): 533–538. PMC 1132043. PMID 1463456. doi:10.1042/bj2880533. 
20. Tseng SJ, Hsu JP (agosto de 1990). "A comparison of the parameter estimating procedures for the Michaelis-Menten model". Journal of Theoretical Biology 145 (4): 457–464. Bibcode:1990JThBi.145..457T. PMID 2246896. doi:10.1016/S0022-5193(05)80481-3. 
21. Bravo IG, Busto F, De Arriaga D, Ferrero MA, Rodríguez-Aparicio LB, Martínez-Blanco H, Reglero A (setembro de 2001). "A normalized plot as a novel and time-saving tool in complex enzyme kinetic analysis". The Biochemical Journal 358 (Pt 3): 573–583. PMC 1222113. PMID 11577687. doi:10.1042/bj3580573. 
22. Almaas E, Kovács B, Vicsek T, Oltvai ZN, Barabási AL (febreiro de 2004). "Global organization of metabolic fluxes in the bacterium Escherichia coli". Nature 427 (6977): 839–843. Bibcode:2004Natur.427..839A. PMID 14985762. arXiv:q-bio/0403001. doi:10.1038/nature02289. 
23. Reed JL, Vo TD, Schilling CH, Palsson BO (2003). "An expanded genome-scale model of Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR)". Genome Biology 4 (9): R54. PMC 193654. PMID 12952533. doi:10.1186/gb-2003-4-9-r54. 
24. para unha derivación completa, ver aquí
25. Dirr H, Reinemer P, Huber R (marzo de 1994). "X-ray crystal structures of cytosolic glutathione S-transferases. Implications for protein architecture, substrate recognition and catalytic function". European Journal of Biochemistry 220 (3): 645–661. PMID 8143720. doi:10.1111/j.1432-1033.1994.tb18666.x. 
26. Stone SR, Morrison JF (xullo de 1988). "Dihydrofolate reductase from Escherichia coli: the kinetic mechanism with NADPH and reduced acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate as substrates". Biochemistry 27 (15): 5493–5499. PMID 3052577. doi:10.1021/bi00415a016. 
27. Fisher PA (1994). Enzymologic mechanism of replicative DNA polymerases in higher eukaryotes. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 47. pp. 371–97. ISBN 978-0-12-540047-3. PMID 8016325. doi:10.1016/S0079-6603(08)60257-3. 
28. Akerman SE, Müller S (agosto de 2003). "2-Cys peroxiredoxin PfTrx-Px1 is involved in the antioxidant defence of Plasmodium falciparum". Molecular and Biochemical Parasitology 130 (2): 75–81. PMID 12946843. doi:10.1016/S0166-6851(03)00161-0. 
29. Bravo IG, Barrallo S, Ferrero MA, Rodríguez-Aparicio LB, Martínez-Blanco H, Reglero A (setembro de 2001). "Kinetic properties of the acylneuraminate cytidylyltransferase from Pasteurella haemolytica A2". The Biochemical Journal 358 (Pt 3): 585–598. PMC 1222114. PMID 11577688. doi:10.1042/bj3580585. 
30. Kraut J (1977). "Serine proteases: structure and mechanism of catalysis". Annual Review of Biochemistry 46: 331–358. PMID 332063. doi:10.1146/annurev.bi.46.070177.001555. 
31. Cornish-Bowden, Athel (2012). Fundamentals of Enzyme Kinetics. Wiley-Blackwell. Algúns encimas son catalizadores moito máis efectivos nunha dirección que na outra. Un exemplo claro é que as velocidades limitantes da reacción cara a adiante catalizada pola metionina adenosiltransferase son unhas 10⁵ veces maiores que na dirección inversa, mesmo no caso de que a constante de equilibrio estea próxima á unidade (páxina 59). 
32. Ricard J, Cornish-Bowden A (xullo de 1987). "Co-operative and allosteric enzymes: 20 years on". European Journal of Biochemistry 166 (2): 255–272. PMID 3301336. doi:10.1111/j.1432-1033.1987.tb13510.x. 
33. Ward WH, Fersht AR (xullo de 1988). "Tyrosyl-tRNA synthetase acts as an asymmetric dimer in charging tRNA. A rationale for half-of-the-sites activity". Biochemistry 27 (15): 5525–5530. PMID 3179266. doi:10.1021/bi00415a021. 
34. Helmstaedt K, Krappmann S, Braus GH (setembro de 2001). "Allosteric regulation of catalytic activity: Escherichia coli aspartate transcarbamoylase versus yeast chorismate mutase". Microbiology and Molecular Biology Reviews 65 (3): 404–21, table of contents. PMC 99034. PMID 11528003. doi:10.1128/MMBR.65.3.404-421.2001. 
35. Schirmer T, Evans PR (xaneiro de 1990). "Structural basis of the allosteric behaviour of phosphofructokinase". Nature 343 (6254): 140–145. Bibcode:1990Natur.343..140S. PMID 2136935. doi:10.1038/343140a0. 
36. Hill AV (1910). "The possible effects of the aggregation of the molecules of haemoglobin on its dissociation curves.". J. Physiol. 40: iv–vii. 
37. Hartley BS, Kilby BA (febreiro de 1954). "The reaction of p-nitrophenyl esters with chymotrypsin and insulin". The Biochemical Journal 56 (2): 288–297. PMC 1269615. PMID 13140189. doi:10.1042/bj0560288. 
38. Fersht, Alan (1999). Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. San Francisco: W.H. Freeman. ISBN 978-0-7167-3268-6. 
39. Bender ML, Begué-Cantón ML, Blakeley RL, Brubacher LJ, Feder J, Gunter CR, et al. (decembro de 1966). "The determination of the concentration of hydrolytic enzyme solutions: alpha-chymotrypsin, trypsin, papain, elastase, subtilisin, and acetylcholinesterase". Journal of the American Chemical Society 88 (24): 5890–5913. PMID 5980876. doi:10.1021/ja00976a034. 
40. Cleland WW (xaneiro de 2005). "The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms". Archives of Biochemistry and Biophysics 433 (1): 2–12. PMID 15581561. doi:10.1016/j.abb.2004.08.027. 
41. Northrop DB (1981). "The expression of isotope effects on enzyme-catalyzed reactions". Annual Review of Biochemistry 50: 103–131. PMID 7023356. doi:10.1146/annurev.bi.50.070181.000535. 
42. Baillie TA, Rettenmeier AW (1986). "Drug biotransformation: mechanistic studies with stable isotopes". Journal of Clinical Pharmacology 26 (6): 448–451. PMID 3734135. doi:10.1002/j.1552-4604.1986.tb03556.x. 
43. Cleland WW (1982). "Use of isotope effects to elucidate enzyme mechanisms". CRC Critical Reviews in Biochemistry 13 (4): 385–428. PMID 6759038. doi:10.3109/10409238209108715. 
44. Christianson DW, Cox JD (1999). "Catalysis by metal-activated hydroxide in zinc and manganese metalloenzymes". Annual Review of Biochemistry 68: 33–57. PMID 10872443. doi:10.1146/annurev.biochem.68.1.33. 
45. Kraut DA, Carroll KS, Herschlag D (2003). "Challenges in enzyme mechanism and energetics". Annual Review of Biochemistry 72: 517–571. PMID 12704087. doi:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161617. 
46. Walsh R, Martin E, Darvesh S (decembro de 2011). "Limitations of conventional inhibitor classifications". Integrative Biology 3 (12): 1197–1201. PMID 22038120. doi:10.1039/c1ib00053e. 
47. Cleland WW (febreiro de 1963). "The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. III. Prediction of initial velocity and inhibition patterns by inspection". Biochimica et Biophysica Acta 67: 188–196. PMID 14021669. doi:10.1016/0006-3002(63)91816-x. 
48. Walsh R, Martin E, Darvesh S (maio de 2007). "A versatile equation to describe reversible enzyme inhibition and activation kinetics: modeling beta-galactosidase and butyrylcholinesterase". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1770 (5): 733–746. PMID 17307293. doi:10.1016/j.bbagen.2007.01.001. 
49. Koshland DE (febreiro de 1958). "Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 44 (2): 98–104. Bibcode:1958PNAS...44...98K. PMC 335371. PMID 16590179. doi:10.1073/pnas.44.2.98. 
50. Hammes GG (xullo de 2002). "Multiple conformational changes in enzyme catalysis". Biochemistry 41 (26): 8221–8228. PMID 12081470. doi:10.1021/bi0260839. 
51. Sutcliffe MJ, Scrutton NS (xullo de 2002). "A new conceptual framework for enzyme catalysis. Hydrogen tunnelling coupled to enzyme dynamics in flavoprotein and quinoprotein enzymes". European Journal of Biochemistry 269 (13): 3096–3102. PMID 12084049. doi:10.1046/j.1432-1033.2002.03020.x. 
52. Henri V (1902). "Theorie generale de l'action de quelques diastases". Compt. Rend. Acad. Sci. Paris 135: 916–9. 
53. Sørensen PL (1909). "Enzymstudien {II}. Über die Messung und Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration bei enzymatischen Prozessen" [Estudos de encimas III: Sobre a medida e importancia da concentración de ión hidróxeno en procesos encimáticos]. Biochem. Z. (en alemán) 21: 131–304. 
54. Michaelis L, Menten M (1913). "Die Kinetik der Invertinwirkung" [A cinética da acción da invertase]. Biochem. Z. (en alemán) 49: 333–369. ; Michaelis L, Menten ML, Johnson KA, Goody RS (outubro de 2011). "The original Michaelis constant: translation of the 1913 Michaelis-Menten paper". Biochemistry 50 (39): 8264–8269. PMC 3381512. PMID 21888353. doi:10.1021/bi201284u. 
55. Briggs GE, Haldane JB (1925). "A Note on the Kinetics of Enzyme Action". The Biochemical Journal 19 (2): 338–339. PMC 1259181. PMID 16743508. doi:10.1042/bj0190338. 
56. Flomenbom O, Velonia K, Loos D, Masuo S, Cotlet M, Engelborghs Y, et al. (febreiro de 2005). "Stretched exponential decay and correlations in the catalytic activity of fluctuating single lipase molecules". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102 (7): 2368–2372. Bibcode:2005PNAS..102.2368F. PMC 548972. PMID 15695587. doi:10.1073/pnas.0409039102. 
57. English BP, Min W, van Oijen AM, Lee KT, Luo G, Sun H, et al. (febreiro de 2006). "Ever-fluctuating single enzyme molecules: Michaelis-Menten equation revisited". Nature Chemical Biology 2 (2): 87–94. PMID 16415859. doi:10.1038/nchembio759. 
58. Lu HP, Xun L, Xie XS (decembro de 1998). "Single-molecule enzymatic dynamics". Science 282 (5395): 1877–1882. Bibcode:1998Sci...282.1877P. PMID 9836635. doi:10.1126/science.282.5395.1877. 
59. Xue X, Liu F, Ou-Yang ZC (setembro de 2006). "Single molecule Michaelis-Menten equation beyond quasistatic disorder". Physical Review E 74 (3 Pt 1): 030902. Bibcode:2006PhRvE..74c0902X. PMID 17025584. arXiv:cond-mat/0604364. doi:10.1103/PhysRevE.74.030902. 
60. Bevc S, Konc J, Stojan J, Hodošček M, Penca M, Praprotnik M, Janežič D (2011). "ENZO: a web tool for derivation and evaluation of kinetic models of enzyme catalyzed reactions". PLOS ONE 6 (7): e22265. Bibcode:2011PLoSO...622265B. PMC 3139599. PMID 21818304. doi:10.1371/journal.pone.0022265.  ENZO server

Véxase tamén

Outros artigos

• Dinámica das proteínas
• Encima de difusión limitada
• Modelo de adsorción de Langmuir

Bibliografía

Introdutoria

• Cornish-Bowden A (2012). Fundamentals of enzyme kinetics (4ª ed.). Weinheim: Wiley-Blackwell. ISBN 978-3-527-33074-4. 
• Stevens L, Price NC (1999). Fundamentals of enzymology: the cell and molecular biology of catalytic proteins. Oxford [Oxfordshire]: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-850229-6. 
• Bugg T (2004). Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry. Cambridge, MA: Blackwell Publishers. ISBN 978-1-4051-1452-3. 
• Segel IH (1993). Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady state enzyme systems. New York: Wiley. ISBN 978-0-471-30309-1. 

Avanzada

• Fersht A (1999). Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. San Francisco: W.H. Freeman. ISBN 978-0-7167-3268-6. 
• Schnell S, Maini PK (2004). "A century of enzyme kinetics: Reliability of the K_M and v_max estimates". Comments on Theoretical Biology 8 (2–3): 169–87. doi:10.1080/08948550302453. 
• Walsh C (1979). Enzymatic reaction mechanisms. San Francisco: W. H. Freeman. ISBN 978-0-7167-0070-8. 
• Cleland WW, Cook P (2007). Enzyme kinetics and mechanism. Nova York: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4140-6. 

Ligazóns extenas

• Animación dun ensaio encimático — Mostra os efectos de manipular as condicións do ensaio
• MACiE — Unha base de datos dos mecanismos de reacción do encima
• ENZYME — A base de datos de nomenclatura de encimas Expasy
• ENZO — Aplicación web para a construción fácil e o testado rápido de modelos cinéticos de reaccións catalizadas por encimas
• ExCatDB — Unha base de datos de mecanismos catalíticos de encimas
• BRENDA — Base de datos de encimas completa, que dá os substratos, inhibidores e diagramas de reacción
• SABIO-RK — Unha base de datos da cinética de reaccións
• Grupo de investigación de Joseph Kraut, Universidade de California San Diego — Animacións de varios mecanismos de reacción de encimas
• Simbolismo e terminoloxía en cinética encimática — Unha explicación completa de conceptos e terminoloxía en cinética encimática
• Unha introdución á cinética encimática — Un conxunto accesible de tutoriais on line sobre cinética encimática
• Titorial animado de cinética encimática — Un titorial animado con audio