Microscopie de fluorescence supercritique

La microscopie de fluorescence supercritique (SAF, Supercritical angle fluorescence microscopy) est une technique particulière de microscopie optique à fluorescence permettant l'observation spécifique d'une tranche supérieure ultra fine d'un échantillon (moins de 100 nm d'épaisseur). Cette technique, plus sélective encore que la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF, limitée à 200 nm), permet de dépasser les limites théoriques que devrait imposer la diffraction de la lumière grâce à une observation dans les angles supercritiques. La méthode a été inventée en 1998 dans les laboratoires de Stefan Seeger^[1] à l'université de Ratisbonne en Allemagne et plus tard à l'université de Zurich en Suisse.

Principe de fonctionnement de la microscopie SAF

Diagrammes polaires de l'émission de fluorescence à l'interface eau/verre. La SAF n'est émise efficacement que si les émetteurs sont très proches de l'interface.

La microscopie SAF utilise une particularité des diffusions de lumière très proches d'une surface de verre. En effet, le comportement de rayonnement des molécules fluorescentes est fortement influencé lorsqu'elles se trouvent à proximité immédiate d'interfaces d'indices de réfraction différents^[2],[3]. Ainsi, Lorsqu'une particule fluorescente s'approche fortement de la surface de verre, elle n'émet pas de lumière dans toutes les directions (on dit qu'il n'y a pas d'émission isotrope). Environ 70% de la fluorescence émise se trouve alors dirigée dans le verre au-dessus de l'angle critique^[1] (angle à partir duquel la lumière n'est plus réfractée mais est réfléchie entre le verre et l'eau de l'échantillon^[4]). A contrario, si la distance de l'émetteur fluorescent s'éloigne à seulement 200 nm au-dessus de la surface, la lumière fluorescente pénétrant dans le verre au-dessus de l'angle critique diminue considérablement. Par conséquent, la microscopie SAF est idéalement adaptée pour distinguer les molécules et les particules sur ou à proximité des surfaces et de tout autre échantillon présent dans la masse ^[5],[6].

Utilisation

Les microscopes SAF permettent d'observer des processus membranaires et d'adhésion dans les cellules vivantes^[7] en détectant et caractérisant les espèces fluorescentes (protéines, biomolécules, produits pharmaceutiques, etc.) et leurs comportements proches voire adsorbés ou liés en surface. La méthode est capable d'observer des molécules à une distance de 100 à 0 nanomètre de la surface, même en présence de fortes concentrations d'espèces fluorescentes aux alentours.

En combinant deux dispositifs sur l'objectif du microscope, la technique SAF permet la détection séparée de la fluorescence de la masse de l'échantillon (détectée par les microscopes à fluorescences classiques) et de sa zone de contact avec le verre de support (lame de microscope) dont la lumière est émise au-dessus de l'angle critique. Dans le cas de l'observation d'une cellule vivante, cette double observation permet de bien séparer les processus membranaires du reste corps cellulaire.

En plus de cette utilisation, la microscopie SAF pourrait permettre de mesurer l'indice de réfraction d'une cellule^[8] et par ce biais la présence de bactérie sans marquage fluorescent dans un échantillon extrêmement petit^[9].

Dispositif SAF typique

Dispositif SAF typique. La lumière fluorescente à angle supercritique est collectée et mesurée par la diode à avalanche APD #2. Les rayons d'incidence sous-critiques sont mesurés avec APD #1.

Pour la microscopie SAF, on utilise un objectif de microscope spécial, qui comprend un miroir parabolique et une lentille asphérique pour obtenir une grande ouverture numérique. Ces deux dispositifs permettent une microscopie parallèle avec deux résolutions différentes le long de l'axe optique^[10],[11]. La lumière fluorescente est ainsi recueillie par ces deux dispositifs parallèles sur des détecteurs, généralement un tube photomultiplicateur ou un détecteur à photodiode à avalanche . Il est également possible d'organiser les éléments SAF sous forme de tableaux et d'imaginer la sortie sur une caméra CCD, permettant la détection de plusieurs analytes ^[12].

La fluorescence émise par l'échantillon est ainsi collectée par deux canaux. D'une part la lumière est recueillie par la lentille asphérique pour voir la masse de l'échantillon permettant d'avoir une microscopie de fluorescence classique. D'autre part, les émissions fluorescentes sont aussi recueillies par une optique parabolique au-dessus de l'angle critique de réflexion interne totale de manière sélective permettant de discriminer les émissions en surface.

Pour éclairer les échantillons, la lumière d'un laser est réfléchie dans la lentille asphérique par un miroir dichroïque. La lentille asphérique concentre le faisceau laser dans l'échantillon, provoquant la fluorescence des particules.

Notes et références

1. (en) Jörg Enderlein, Thomas Ruckstuhl et Stefan Seeger, « Highly efficient optical detection of surface-generated fluorescence », Applied Optics, vol. 38, n^o 4,‎ 1^er février 1999, p. 724–732 (ISSN 2155-3165, DOI 10.1364/AO.38.000724, lire en ligne, consulté le 3 juin 2020)
2. (en) Lukosz, W et Kunz, R. E., « Light emission by magnetic and electric dipoles close to a plane interface. I. Total radiated power », JOSA, vol. 67, n^o 12,‎ 1977, p. 1607-1615 (lire en ligne)
3. (en) Lukosz, W et Kunz, R. E., « Light emission by magnetic and electric dipoles close to a plane interface. II. Radiation patterns of perpendicular oriented dipoles », JOSA, vol. 67, n^o 12,‎ 1977, p. 1615-1619 (lire en ligne)
4. En microsocpie avec des échantillons biologiques, les particules fluorescentes sont généralement situées dans un milieu aqueux (indice de réfraction ${\displaystyle n_{0}=1{,}33}$) sur une lame de verre de microscope (indice de réfraction ${\displaystyle n_{1}=1{,}52}$). L'angle critique ${\displaystyle \theta _{\mathrm {c} }}$ de l'interface eau/verre est alors de 61°.
5. (en) Thomas Ruckstuhl, Michael Rankl et Stefan Seeger, « Highly sensitive biosensing using a supercritical angle fluorescence (SAF) instrument », Biosensors and Bioelectronics, vol. 18, n^o 9,‎ 15 août 2003, p. 1193–1199 (ISSN 0956-5663, DOI 10.1016/S0956-5663(02)00239-7, lire en ligne, consulté le 3 juin 2020)
6. (en) Thomas Ruckstuhl et Stefan Seeger, « Attoliter detection volumes by confocal total-internal-reflection fluorescence microscopy », Optics Letters, vol. 29, n^o 6,‎ 15 mars 2004, p. 569–571 (ISSN 1539-4794, DOI 10.1364/OL.29.000569, lire en ligne, consulté le 3 juin 2020)
7. « Institut des Sciences Moléculaires d’Orsay - UMR 8214 - Microscopie de fluorescence supercritique (SAF) », sur www.ismo.u-psud.fr (consulté le 29 mai 2020)
8. (en) Maia Brunstein, Lopamudra Roy et Martin Oheim, « Near-Membrane Refractometry Using Supercritical Angle Fluorescence », Biophysical Journal, vol. 112, n^o 9,‎ 9 mai 2017, p. 1940–1948 (ISSN 0006-3495, DOI 10.1016/j.bpj.2017.03.008, lire en ligne, consulté le 3 juin 2020)
9. Boris Ferdman, Lucien E. Weiss, Onit Alalouf et Yonathan Haimovich, « Ultrasensitive Refractometry via Supercritical Angle Fluorescence », ACS Nano, vol. 12, n^o 12,‎ 26 décembre 2018, p. 11892–11898 (ISSN 1936-0851, DOI 10.1021/acsnano.8b05849, lire en ligne, consulté le 3 juin 2020)
10. (en) Ruckstuhl, T. et Verdes, D, « Supercritical angle fluorescence (SAF) microscopy », Optics express, vol. 12, n^o 12,‎ 2004, p. 4246-4254 (lire en ligne)
11. (en) Verdes, D, Ruckstuhl, T et Seeger, S, « Parallel two-channel near-and far-field fluorescence microscopy », Journal of biomedical optics, vol. 12, n^o 3,‎ 2007, p. 034012 (lire en ligne)
12. Hill, McDonnell B, Hearty S et Basabe-Desmonts L, « Novel disposable biochip platform employing supercritical angle fluorescence for enhanced fluorescence collection. », Biomedical Microdevices, vol. 13, n^o 4,‎ 11 mai 2011, p. 759–67 (PMID 21559870, DOI 10.1007/s10544-011-9546-2)

Liens externes