Le film démarre par un monologue face caméra de Bernard Blier, présentant Le Monocle Noir comme un film d'espionnage et d'humour noir. L'acteur rend hommage au colonel Rémy, auteur du roman dont est inspiré ce long-métrage.
En Bretagne, dans le Morbihan, deux hommes en assomment un troisième au cours de la nuit puis installent son corps dans une voiture qu'ils jettent dans un fleuve. La voiture et le corps sont repêchés le lendemain matin par les autorités. Le crime a eu lieu à proximité d'un château ouvert au public en journée. Le conservateur du château, Hubert Mérignac, fait la connaissance d'Erika Murger, une étudiante en architecture. Des sentiments réciproques semblent naître entre eux. Un mystérieux homme aveugle portant un monocle noir est également présent au château.
Le Monocle, Hubert Mérignac et Erika Murger se rendent un soir chez le marquis de Villemaur, qui organise un dîner pour son anniversaire avec d'autres invités : Heinrich Von March, Mathias Fischer, Raymond et Jean. En l'absence de Mérignac et d'Erika, partis se promener dans le jardin, la fête se transforme en réunion secrète d'un groupuscule néonazi mené par le marquis. Un nouveau membre est présenté à l'assemblée : le commandant Brozzi, néofasciste italien. Le spectateur apprend que les deux meurtriers du début du film sont des hommes de main travaillant pour le compte du marquis. Leur victime était un agent français.
À l'issue de la réunion, Heinrich Von March prévient le marquis qu'il y a un traître parmi eux. Il s'agit de Matthias Fischer, qui s'aprêtait à se marier avec la fille du marquis. Le jeune homme est en réalité un agent russe. Celui-ci tente de s'échapper et une course-poursuite s'engage avec les autres membres du groupuscule. La secrétaire d'Hubert Mérignac, Monique Abadie, l'aide à s'échapper. Tous deux sont poursuivis : Matthias est touché d'une balle de fusil et chute dans une rivière tandis que la jeune femme est tuée alors qu'elle sonnait à la porte d'Hubert Mérignac, qui découvre son corps poignardé.
De retour au château, le Monocle s'avère être un agent français du nom de Dromard, enquêtant sur les agissements du marquis de Villemaur avec l'aide de son assistant Trochu. Sa supposée cécité est un leurre. Le comportement de Dromard reste suspect aux yeux du spectateur : l'agent français fait injustement arrêter Hubert Mérignac par le commissaire Tournemire pour le meurtre de Monique Abadie. Le spectateur comprend peu après que cette dénonciation avait pour but d'éloigner la police du château de manière à éviter de troubler la mission d'infiltration de Dromard au sein du groupuscule néonazi. Erika Murger s'avère également être une espionne : une certaine rivalité existe entre elle et Dromard du fait que chacun mène sa propre enquête dans le même but. Erika est à la recherche d'un ancien nazi dénommé Görmann, qui semble être caché au sein du château par le marquis et n'a pas encore été aperçu. Dromard considère que l'enquête est trop dangereuse pour la jeune femme et l'enferme dans une pièce de son appartement.
Alors que Dromard inspecte les souterrains du château du marquis avec son assistant, les deux hommes sont démasqués et Trochu est capturé par le groupuscule. La fille du marquis, Bénédicte, cache quant à elle Mathias dans sa chambre après l'avoir secouru. Mathias décide d'aller secourir Trochu qui est retenu dans le grenier du marquis. Libéré, Trochu retrouve Dromard alors que celui-ci vient d'échapper à l'explosion d'une bombe déposée dans sa voiture. Entre-temps, Erika s'est enfuie de chez Dromard pour aller à son tour au château du marquis et découvrir où est caché Görmann.
Dromard, Trochu, Mérignac, le commissaire Tournemire et les troupes de la police montent une opération le soir même pour arrêter le marquis et ses hommes, capturer Görmann et retrouver Erika. Pris par surprise, les membres du groupuscule tentent de fuir par les souterrains. Mathias, toujours caché par Bénédicte, rejoint le camp des assaillants et prête main-forte aux autorités françaises tandis que la fille du marquis, qui hésite à défendre les intérêts de son père, est arrêtée. Un à un, les hommes du marquis tombent sous les balles de leurs poursuivants. Mathias est blessé par Von March, qui est à son tour blessé par Dromard. Ce dernier, arrivé dans un cul-de-sac, ordonne à l'introuvable Görmann de se rendre. Pour toute réponse, le corps du marquis tombe devant lui, tué par Erika. Un bref instant, Erika est soupçonnée d'être Görmann, mais la jeune femme était seulement retenue prisonnière par le marquis et s'est débarrassée de lui. Von March, agonisant, avoue que Görmann n'a en réalité jamais été présent au château car il est mort à Berlin en 1945. La légende de sa survie a simplement été entretenue par Von March pour se donner davantage d'importance au sein du groupuscule. En guise d'épilogue, Dromard et Erika s'embrassent, provoquant le dépit d'Hubert Mérignac.
Georges Lautner n'a pas caché qu'il n'avait pas aimé le roman du colonel Rémy, le jugeant trop sérieux et trop violent. C'est au départ uniquement pour pouvoir travailler qu'il a accepté d'en réaliser l'adaptation, mais il a réussi à contourner les exigences des producteurs et à alléger grandement les côtés sinistres du roman, en le transformant en comédie policière.
Chose étonnante, le film Le Monocle noir a été diffusé en VHS (sorti en )... mais ne fut diffusé en DVD qu'en octobre 2012. Une lacune surprenante car le deuxième volet de la série (L'Œil du Monocle) et le troisième volet (Le Monocle rit jaune) ont, eux, été très tôt diffusés en DVD.
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