Elle constitue la gare de jonction entre le réseau ferré national et le réseau ferré du port autonome de Strasbourg (PAS).
En raison de la configuration des voies de la gare, il est impossible d’entrer ou de sortir depuis la direction de l’Allemagne. Les trains en provenance ou à destination de l’Allemagne sont obligés de se rendre à Strasbourg-Neudorf pour y effectuer un tête à queue.
En plus du trafic marchandises, la gare est également ouverte au service des voyageurs. Sa fréquentation est alors principalement représentée par les ouvriers du port et des entreprises voisines. La gare aux marchandises — appelée « gare locale » — se trouvait à proximité du bassin du Commerce tandis que la gare voyageurs était située vers le centre du quartier, à l'angle des actuelles rue Coulaux et route de l'Île des Épis. Elle comportait un bâtiment voyageurs en grès rose et un quai central desservi par deux voies. L'accès au quai se faisait par un escalier situé sous le pont de chemin de fer. Un bâtiment comportant un logement de service pour les gérants de la gare (dont les plans ont été validés en 1901) se trouvait en face du bâtiment voyageurs[3]. Outre la gare aux marchandises et la gare voyageurs, de nombreux embranchements desservent les différents bassins et entreprises du port.
Le faisceau triage de la gare est agrandi en 1920 pour faire face à l’augmentation du trafic portuaire.
En 1929, sept allers-retours quotidiens (six les dimanches et fêtes) à destination d'Appenweier assurent la desserte voyageurs.
En 1930 on projette la construction d’une nouvelle gare de triage au sud du port. Cette dernière doit pouvoir recevoir et former des trains pour les directions de Bâle, Saint-Dié-des-Vosges, Hausbergen et Kehl. Une première étape prévoit la réalisation d’un faisceau d’entrée de 12 voies, d’un faisceau de triage de 38 voies comportant deux bosses de gravité, d’un faisceau de sortie de 13 voies, d’un faisceau de classement de 14 voies desservie par une bosse, d’un faisceau pour trains directs de 3 voies et un dépôt pouvant accueillir 38 machines. Ces installations doivent permettre de traiter 2 400 à 4 200 wagons par jour. Une seconde étape envisage la réalisation d’infrastructures supplémentaires avec 12 voies d’entrée, 28 voies de triage, 9 voies de sortie, 14 voies de classement et une extension du dépôt pour 171 machines. Le trafic pourrait alors atteindre 3 900 à 6 700 wagons quotidiens[4]. Ces travaux ne seront finalement jamais réalisés.
L'accord franco-allemand du 1925 concernant les gares frontières cesse d'être en vigueur à partir du 1939 après avoir été dénoncé par le Reich. La SNCF envisage alors la construction d'une gare douanière à Strasbourg-Port-du-Rhin ou à Strasbourg-Neudorf. Le projet est abandonné à la suite de la déclaration de guerre entre la France et l'Allemagne[5].
La gare était encore ouverte au service des voyageurs au début des années 1950. Cependant le quai central et le bâtiment voyageurs sont détruits entre 1956 et 1958 lors des travaux de construction du nouveau pont sur le Rhin mettant ainsi un terme à la desserte voyageurs. Un nouveau bâtiment, à usage de bureaux, est construit à l'emplacement de l'ancien bâtiment voyageurs.
En 1964 le trafic marchandises de la gare du Port-du-Rhin était de 6,5 millions de tonnes[7].
La bosse située à l’entrée du sous-triage permettait le tri des wagons à la gravité.
Dans les années 1970, la gare dispose de trois A1AA1A 62000 pour le débranchement des wagons et la desserte des embranchements et extensions du port[8].
Bien que la gare n’était plus desservie par des trains de voyageurs, un guichet permettant l’achat de billets et l’envoi de colis a subsisté jusqu’en 1985.
Dans les années 2010, le réseau ferré portuaire est amputé de plusieurs kilomètres de voies : les voies situées rue de la Minoterie, rue du Havre — ces dernières permettaient d’accéder au môle Seegmuller — et rue de la Ganzau sont déposées.
Des travaux de réfection sur le pont tournant ferroviaire du canal de la Marne au Rhin, construit en 1925, sont réalisés en 2018. La même année, le trafic représente environ 6 500 trains et 25 000 manœuvres. Le faisceau de triage de la gare est allongé et électrifié en 2020. Le terminal conteneurs sud dispose de plusieurs voies ferrées inutilisées que le port souhaite remettre en service comme alternative au terminal nord qui approche de la saturation[14]. Le port désire ainsi aménager une extension du terminal sud à l’horizon 2026. D’une superficie de 4,2 hectares, celle-ci comportera deux nouvelles voies de 750 mètres, un mur de quai de 140 mètres et une grue portique trimodale[15].
En 2024, Fret SNCF reprend les manœuvres en gare ainsi que les dessertes.
Le bâtiment de bureaux de la gare se trouve à l'angle de la rue Coulaux et de la route de l'Île des Épis. Le poste 1 est situé juste en face de l'autre côté des voies, rue du bassin de l'Industrie.
La gare comporte plusieurs faisceaux : le « triage » avec 14 voies (voies 5 à 18 ; les voies 2, 3 et 4, en impasse, sont fermées à la circulation), le « sous-triage » avec huit voies (voies 22 et 24 à 30) et « l’Orangerie » avec quatre voies (voies 31, 32, 38 et 40). Le terminal conteneurs nord est situé à l’emplacement de l’ancienne « gare locale » et compte six voies.
Le réseau ferré portuaire représente une centaine de kilomètres de voies. De par son étendue, il est divisé en cantons gérés par l’aiguilleur du poste 1. Entre 15 et 20 installations terminales embranchées sont desservies régulièrement. L’accès au secteur sud du réseau ferré portuaire peut également se faire par la gare de Strasbourg-Neudorf.