Po čtyřletém turné s Theatre X po Spojených státech a Evropě se přestěhoval do New Yorku a přidal se k experimentální divadelní skupině The Performance Group. Dafoeova filmová kariéra začala v roce 1981, když si zahrál ve filmu Nebeská brána (Heaven's Gate), ale jeho role byla z filmu vystřižena. V polovině 80. let byl obsazen Williamem Friedkinem do filmu Žít a zemřít v L. A., ve kterém Dafoe ztvárnil roli padělatele Ricka Masterse. O rok později hrál vůdce motorkářského gangu ve filmu Nemilovaná (The Loveless) a později hrál podobnou roli ve filmu Ohnivé ulice, ale jeho zlomovou rolí byla postava soucitného seržanta Eliase ve filmu Četa (1986). V roce 1988 Dafoe hrál v jiném filmu zasazeného do války ve Vietnamu – ve filmu Saigon ztvárnil roli vyšetřovatele, agenta Bucka McGriffa. Od té doby se stál populárním charakterním hercem. Často hraje vznětlivé a podlé role, jako je třeba Green Goblin ve filmech o Spider-Manovi a Barillo ve filmu Tenkrát v Mexiku. Předtím byl zvažován k obsazení role Jokera ve filmu Tima Burtona a Sama Hamma z roku 1989 Batman. Hamm vzpomíná: „Připadlo nám, že Willem Dafoe vypadá přesně jako Joker.“ Roli nakonec dostal Jack Nicholson. Také ztvárnil Ježíše ve filmu Poslední pokušení Krista (1988). Tenkrát poznamenal: „Do dneška jsem nemohl uvěřit, že jsem byl tak drzý, abych hrál roli Ježíše“.
Hrál v erotickém thrilleru Tělo jako důkaz s Madonnou. V tomto filmu se objevil nahý, ve scéně na parkovišti, kde Madonně provádí orální sex. V roce 1991 Willem Dafoe ztvárnil manhattanského drogového dealera ve filmu Muž bez spánku. Tento film byl přijat kladně jak diváky, tak i kritiky. Dafoe hrál excentrického agenta FBI ve filmu Pokrevní bratři (1999) a ve filmu Americké psycho (2000). Hrál také v animovaném filmu Hledá se Nemo, kde propůjčil hlas Gillovi.
Dafoe potkal režisérku Elizabeth LeCompte u The Performance Group. LeCompte a Dafoe částečně obnovili The Performance Group a stali se spolupracovníky a zakládajícími členy The Wooster Group, a poté vznikl jejich vztah. Jejich syn Jack se narodil v roce 1982. Pár se rozešel v roce 2004. Dafoe si vzal italskou režisérku a herečku Giadu Colagrande 25. března 2005.