DOS API最初是86-DOS中的应用程序接口(API),并也被MS-DOS/PC-DOS及其他DOS兼容操作系统使用。大多数对DOS API的调用是使用中斷21h(INT(英语:INT (x86 instruction)) 21h)。在调用INT 21h时,在AH 寄存器中带有子函数号,其他寄存器中带有其他参数,从而调用各个DOS服务。DOS服务包括键盘输入、视频输入、磁盘文件访问、执行程序、内存分配及其他事务。在1980年代后期,围绕DOS保护模式接口(英语:DOS Protected Mode Interface)(DPMI)的DOS扩展器允许程序在16位元或32位元的保护模式下运行,并仍可访问DOS API。
在86-DOS和MS-DOS 1.0中的原始DOS API在设计上与CP/M兼容。文件访问使用文件控制块(英语:file control block)(FCB)。在MS-DOS 2.0中的DOS API大大扩展了数个Unix概念,包括使用文件描述符、分层目录和设备I/O控制的文件访问。[1]DOS 3.1中添加了网络重定向器(英语:network redirector)的支持。MS-DOS 3.31中,INT 25h/26h函数被增强以支持大于32MB的硬盘。MS-DOS 5添加了使用高端内存块(英语:upper memory blocks)(UMB)的支持。在MS-DOS 5之后,连续、独立发布的DOS没有改变DOS API。
在Windows 9x,DOS通常作为引导加载程序加载受保护模式的操作系统和图形外壳。DOS通常从一个DOS虚拟机(英语:virtual DOS machine)(VDM)访问,但也可以不加载Windows而直接启动到真实模式的MS-DOS 7.0。DOS API已增强国际化和长文件名支持,尽管长文件名支持仅在VDM中可用。随着Windows 95 OSR2,DOS被更新到7.1,添加了FAT32及对其DOS API的支持。Windows 98和Windows Me也实现了MS-DOS 7.1 API,尽管Windows ME本身自称为MS-DOS 8.0。
Windows NT及基于它的系统(例如Windows XP和Windows Vista)不是基于MS-DOS,但也可使用一个虛擬機器——NTVDM(英语:NTVDM)处理DOS API。NTVDM将DOS程序在虚拟8086模式(Intel 80386及更高处理器上可在保護模式下进行真實模式的仿真)模式下运行。NTVDM支持DOS 5.0 API。面向Linux的DOSEMU(英语:DOSEMU)使用类似的方法。
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