Marcello Mastroiannis föräldrar var fattiga lantbrukare. Under andra världskriget arbetade han en kort period som tecknare, innan han sändes till ett arbetsläger av tyskarna. Han lyckades rymma och tillbringade återstoden av kriget i ett vindsrum i Venedig.
Efter kriget begav han sig till Rom, där han på dagarna arbetade som kontorist och på kvällarna började spela teater med några universitetsstuderande. Han var som medlem av Luchino Viscontis scenensemble[1] en del av förnyelsen av italiensk teater åren efter kriget.
Marcello Mastroianni gjorde sin filmdebut 1948 i en ej krediterad roll som revolutionär i Samhällets olycksbarn, en italiensk version av romanen med samma titel. Från mitten av 1950-talet etablerade han sig som internationell stjärna.
Marcello Mastroianni var gift med en och samma kvinna från 1950 fram till sin död. Likväl hade han flera omtalade kärleksaffärer. I slutet av 1960-talet med Faye Dunaway, som han träffade under inspelningen av Amanti. Åren 1971–1975 hade han ett kärleksförhållande med den franska skådespelerskan Catherine Deneuve med vilken han fick dottern Chiara.