Флуоресцентная гибридизация in situ

Метафазная пластинка с филадельфийской хромосомой. Хромосомы окрашены в синий цвет, локус ABL1 — красный цвет, локус BCR — зелёный цвет. Вверху слева — хромосома с перестройкой, отмечена красно-зеленой точкой

Флуоресце́нтная гибридиза́ция in situ, или метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization — FISH), — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике^[1], в диагностике онкологических заболеваний^[2], в ретроспективной биологической дозиметрии^[3].

Зонды

Кариотипирование при помощи многоцветного FISH

При флуоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флуоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стрептавидина, а дигоксигенин — при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3—4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала^[4].

Флуоресцентная гибридизация in situ на хромосомах курицы. Стрелки указывают на меченные локусы гомологичных макрохромосом; видны также многочисленные мелкие пятнышки — микрохромосомы

Для создания ДНК-зондов используют клонированные последовательности ДНК (например, NoiI-связующие клоны 3-й хромосомы человека, БАК^[англ.]-клоны)^[5][6], геномную ДНК, продукты ПЦР, меченые олигонуклеотиды, а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции^[4].

Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путём ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

Процедура гибридизации

Схема эксперимента по флуоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс. п. о.), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70 °C.

Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флуоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флуоресцентного красителя.

См. также

RGEN-ISL Метод молекулярной визуализации с помощью РНК-направляемой эндонуклеазы CRISPR/dCas9 связанной с меткой. В отличие от классической флуоресцентной гибридизации in situ, RGEN-ISL не требует денатурации ДНК и, следовательно, обеспечивает лучшую сохранность структуры хроматина.

Примечания

1. Шилова Н. В., Золотухина Т. В. Интерфазная флуоресцентная гибридизация in situ в диагностике числовых хромосомных аберраций// Медицинская генетика. — 2007. — Т. 6. — № 10. — С. 53—58.
2. Bridge J. A., Cushman-Vokoun A. M.. Molecular diagnostics of soft tissue tumors (неопр.) // Archives of Pathology & Laboratory Medicine. — 2011. — May (т. 135, № 5). — С. 588—601. — doi:10.1043/2010-0594-RAIR.1. — PMID 21526957.
3. Ainsbury E. A., Bakhanova E., Barquinero J. F. et al. Review of retrospective dosimetry techniques for external ionising radiation exposures (англ.) // Radiation Protection Dosimetry : journal. — 2011. — November (vol. 147, no. 4). — P. 573—592. — doi:10.1093/rpd/ncq499. — PMID 21183550. Архивировано 20 ноября 2015 года.
4. Рубцов Н. Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие. — Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т, 2006. — 152 с. — ISBN 5-94356-376-8. Архивировано 2 апреля 2015 года.
5. Sazanov A. A., Sazanova A. L., Stekol’nikova V. A., Kozyreva A. A., Romanov M. N., Malewski T., Smirnov A. F. Chromosomal localization of seven HSA3q13→q23 NotI linking clones on chicken microchromosomes: orthology of GGA14 and GGA15 to a gene-rich region of HSA3 (англ.) // Cytogenetic and Genome Research^[англ.] : журнал. — Basel, Switzerland: Karger Publishers, 2005. — Vol. 111, no. 2. — P. 128—133. — ISSN 1424-8581. — doi:10.1159/000086381. — PMID 16103653. Архивировано 15 марта 2015 года. (Дата обращения: 15 марта 2015)
6. Sazanov A. A., Romanov M. N., Sazanova A. L., Korczak M., Stekol'nikova V. A., Kozyreva A. A., Smirnov A. F., Jaszczak K., Dodgson J. B. Chromosomal localization of 15 large insert BAC clones containing three microsatellites on chicken chromosome 4 (GGA4) which refine its centromere position (англ.) // Animal Genetics : журнал. — Oxford, UK: International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd, 2005. — Vol. 36, no. 2. — P. 161—163. — ISSN 0268-9146. — doi:10.1111/j.1365-2052.2004.01225.x. — PMID 15771730. Архивировано 2 апреля 2015 года. (Дата обращения: 15 марта 2015)

Литература

• Рубцов Н.Б. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе хромосомных аномалий // Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний. Введение в молекулярную диагностику / Под ред. М. А. Пальцева, Д. В. Залетаева. — М.: Медицина, 2011. — Т. 2. — С. 100—136. — 1000 экз. — ISBN 978-5-225-03557-0.