Путь Энтнера — Дудорова

Путь Э́нтнера — Ду́дорова, или КДФГ-путь^[1] (англ. Entner–Doudoroff pathway) — путь окисления глюкозы (наряду с гликолизом и пентозофосфатным путём), приводящий к образованию из одной молекулы глюкозы двух молекул пирувата, одной молекулы АТФ и двух молекул восстановленных пиридиновых нуклеотидов (НАД٠Н и НАДФ٠Н)^[2]. Хотя ранее считалось, что он имеет место лишь у небольшого числа грамотрицательных бактерий, в настоящее время установлено, что этот путь распространён в природе чрезвычайно широко и используется различными группами грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также некоторыми археями и даже эукариотами^[3].

История открытия

Сообщение об открытии пути Энтнера — Дудорова было опубликовано в 1952 году американскими учёными Натаном Энтнером и Михаилом Дудоровым^[4]. В своей работе они предоставили убедительные доказательства наличия у бактерии Pseudomonas saccharophila^[англ.] нового, ранее не описанного, пути метаболизма глюкозы. Их выводы были основаны на наблюдении, что первый атом углерода (С1) у глюкозы почти весь уходит в СО₂, при этом механизм метаболизма глюкозы явно не включал первичное декарбоксилирование молекулы глюкозы. Используя клетки, обработанные динитрофенолом, они установили, что 1 моль глюкозы, меченной по С1, в конечном счёте превращался в 2 моля пировиноградной кислоты (пирувата), причём все меченные атомы находились в карбоксильной группе пирувата. Кроме того, в неочищенных экстрактах клеток была обнаружена ферментативная активность по расщеплению 6-фосфоглюконовой кислоты^[англ.] на пируват и глицеральдегид-3-фосфат. Они также предположили, что ключевым соединением на пути расщепления шестиуглеродного соединения на два трёхуглеродных был 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат (КДФГ). В дальнейшем КДФГ был выделен в кристаллическом виде из ферментной клеточной смеси с 6-фосфоглюконовой кислотой. Два этапа пути — образование КДФГ из 6-фосфоглюконата и расщепление КДФГ на пируват и глицеральдегид-3-фосфат — были установлены после выделения ферментов, осуществляющих эти превращения (подробнее см. ниже)^[3].

Механизм

Схема пути Энтнера — Дудорова

Внешние изображения
	Схема пути Энтнера — Дудорова с указанием формул соединений

Структура 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

Общая схема пути Энтнера — Дудорова такова. Глюкозо-6-фосфат, образовавшийся при фосфорилировании 1 молекулы глюкозы с затратой 1 молекулы АТФ, переходит в 6-фосфоглюконат с восстановлением молекулы НАДФ и образованием НАДФ٠Н^[5]. При дальнейшей дегидратации 6-фосфоглюконата образуется 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат (КДФГ) — ключевое соединение пути^[3]. КДФГ расщепляется на пируват и глицеральдегид-3-фосфат (3-ФГА). При дальнейшем окислении 3-ФГА до пирувата восстанавливается 1 молекула НАД до НАДН и образуется 2 АТФ путём субстратного фосфорилирования. В пути Энтнера — Дудорова задействованы 2 уникальных фермента: 6-фосфоглюконатдегидратаза^[англ.], превращающая 6-фосфоглюконат в КДФГ, и КДФГ-альдолаза, катализирующая альдольное расщепление^[англ.] КДФГ на пируват и 3-ФГА^[6].

Путь Энтнера — Дудорова можно рассматривать как альтернативу гликолизу. Общая схема двух этих путей окисления глюкозы чрезвычайно похожа: 6-углеродные сахара активируются фосфорилированием и после этого разлагаются ферментами группы альдолаз на два трёхуглеродных соединения. Различие заключается в природе промежуточных 6-углеродных соединений, которые разлагаются на трёхуглеродные продукты. При гликолизе фруктозо-1,6-бифосфат разлагается на 3-ФГА и дигидроксиацетонфосфат, а при пути Энтнера — Дудорова КДФГ расщепляется на 3-ФГА и пируват^[3]. Таким образом, путь Энтнера — Дудорова содержит только две реакции, дополнительные к реакциям гликолиза и пентозофосфатного пути. Однако путь Энтнера — Дудорова отличается от гликолиза тем, что в нём образуется одна молекула НАДФ٠Н и в качестве суммарного энергетического выхода всего лишь одна, а не две, молекулы АТФ^[6].

Распространение и физиология

Среди бактерий путь Энтнера — Дудорова описан почти исключительно у грамотрицательных бактерий; редкое исключение — грамположительная кишечная бактерия Enterococcus faecalis^{[англ.][7]}.

Различные организмы используют путь Энтнера — Дудорова по-разному. Только у небольшого числа организмов путь Энтнера — Дудорова задействован исключительно в катаболизме, протекает по линейному механизму, используется постоянно (конститутивно) и составляет основу центрального метаболизма. Так, в частности, происходит у Zymomonas mobilis^[англ.]; эта бактерия также является единственным известным организмом, облигатно использующим путь Энтнера — Дудорова в анаэробных условиях. Образующийся в ходе этого пути пируват превращается в ацетальдегид, который превращается в этанол и углекислый газ, т. е. Zymomonas mobilis осуществляет спиртовое брожение^[3]. Вообще, бродильщики не используют путь Энтнера — Дудорова, по-видимому, из-за низкого выхода АТФ, поскольку брожение также характеризуется низким энергетическим КПД использования сахаров^[6]. Кроме Zymomonas mobilis, анаэробно путь Энтнера — Дудорова используется также клостридиями^[3].

У многих бактерий, в частности кишечных, путь Энтнера — Дудорова протекает по линейному механизму и индуцируется только при росте на определённых источниках углерода, например, на глюконате, а основу центрального метаболизма составляют гликолиз и пентозофосфатный путь. Такова, например, E. coli. У неё синтез ферментов пути Энтнера — Дудорова начинается только при наличии глюконата во внешней среде. Образующийся в ходе пути Энтнера — Дудорова пируват вовлекается в цикл Кребса^[3]. Кроме того, в присутствии экзогенного пирролохинолинхинона (PQQ), кофактора глюкозооксидазы, E. coli и некоторые другие бактерии способны окислять глюкозу до глюконата с помощью этого фермента. После этого глюконат фосфорилируется и превращается в 6-фосфоглюконат, который далее используется по пути Энтнера — Дудорова. В других случаях глюконат может окисляться глюконатдегидрогеназой до 2-кетоглюконата, который далее фосфорилируется и вновь восстанавливается до 6-фосфоглюконата^[6].

У большей части псевдомонад^[англ.] путь Энтнера — Дудорова протекает по особому циклическому механизму. 3-ФГА, образовавшийся при расщеплении КДФГ КДФГ-альдолазой, при помощи глюконеогенических ферментов непосредственно превращается в 6-фосфоглюконат. Кроме псевдомонад, циклический вариант пути Энтнера — Дудорова описан у некоторых родственных микроорганизмов, в частности Azotobacter vinelandii и других^[3].

Путь Энтнера — Дудорова используется также некоторыми метилотрофными микроорганизмами. Некоторые облигатные и факультативные метилотрофы фиксируют формальдегид с помощью рибулозомонофосфатного пути (англ. ribulose monophosphate pathway, RMP). В первой стадии этого пути происходит образование фруктозо-6-фосфата из формальдегида и рибулозо-5-фосфата^[англ.]. Во второй стадии в некоторых вариантах RMP фруктозо-6-фосфат превращается в трёхуглеродные соединения по пути Энтнера — Дудорова. Вначале фруктозо-6-фосфат переводится в изомерный глюкозо-6-фосфат, который по пути Энтнера — Дудорова расщепляется на пируват и 3-ФГК. Последний затем переводится в рибулозо-5-фосфат. Такой вариант углеводного метаболизма выявлен у ряда облигатных метилотрофов, а также некоторых факультативных. Таким образом, в этом случае путь Энтнера — Дудорова оказывается вовлечённым в анаболический процесс (образование рибулозо-5-фосфата), поэтому он может иметь значение не только в катаболических, но и анаболических процессах^[3].

Phaeodactylum tricornutum — диатомея, которая использует путь Энтнера — Дудорова

Исследование 2015 года показало, что морские бактерии в значительной мере зависят от пути Энтнера — Дудорова. В ходе этого исследования рассматривались различные штаммы морских бактерий, использующих глюкозу и принадлежащих к разным, филогенетически далёким группам бактерий: филумам Alphaproteobacteria^[англ.], Gammaproteobacteria и Bacteroidetes. Оказалось, что 90 % штаммов использовали путь Энтнера — Дудорова для метаболизма глюкозы, а путь Эмбдена — Мейергофа — Парнаса (обычный гликолиз) — только лишь 10 %. Наземные бактерии, напротив, используют преимущественно второй путь, который даёт больший выход АТФ. У морских бактерий использование пути Энтнера — Дудорова обеспечивает большую устойчивость к окислительному стрессу. Таким образом, путь Энтнера — Дудорова может играть важную роль в превращениях моно- и полисахаридов в бактериальных сообществах^[англ.] морских экосистем^[8].

У холерного вибриона Vibrio cholerae путь Энтнера — Дудорова необходим для использования глюконата и имеет важное значение для вирулентности этой бактерии^[9]. Исследование 2014 года показало, что у патогена растений Xanthomonas campestris^[англ.] путь Энтнера — Дудорова является главным путём катаболизма глюкозы^[10].

Как упоминалось выше, путь Энтнера — Дудорова обнаружен у некоторых эукариот, а именно Entamoeba histolytica, Aspergillus niger и Penicillum notatum^[англ.]. Кроме того, ферменты, близкие к 6-фосфоглюконатдегидратазе и КДФГ-альдолазе, были обнаружены в печени коровы, они участвуют в синтезе гидроксипролина^[3]. Путь Энтнера — Дудорова описан и у некоторых фотосинтезирующих эукариот, в частности, диатомовой водоросли Phaeodactylum tricornutum. У этой водоросли реакции пути протекают в митохондриях. Возможно, наличие такого варианта даёт возможность водоросли использовать вместо высокоэффективного пути катаболизма глюкозы, для синтеза ферментов которого требуется много энергии (обычного гликолиза), путь с меньшей эффективностью, но и менее затратный с точки зрения синтеза ферментов, что может давать определённое преимущество^[11].

В 2014 году была предпринята попытка внедрить путь Энтнера — Дудорова в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для этого в клетках дрожжей экспрессировали 6-фосфоглюконатдегидратазу и КДФГ-альдолазу E. coli. Однако попытка не увенчалась успехом: КДФГ-альдолаза E. coli, содержащая железо-серные кластеры, не могла нормально функционировать в дрожжевых клетках^[12].

Модификации

Нефосфорилированный вариант пути Энтнера — Дудорова. КДГ — 2-кето-3-дезокси-6-глюконовая кислота (КДГ), ГА — глицеральдегид, 2-ФГ — 2-фосфоглицериновая кислота, ФЕП — фосфоенолпируват, Пир — пируват

Существуют следующие модификации пути Энтнера — Дудорова:

• У галофильных архей и некоторых бактерий (Rhodobacter sphaeroides^[англ.], некоторых видов Clostridium) глюкоза окисляется до глюконата, который дегидратируется с образованием 2-кето-дезоксиглюконата, который только после этого фосфорилируется с образованием КДФГ^[6][3].
• У термоацидофильных архей родов Thermoplasma, Thermoproteus^{[англ.][13]} и Sulfolobus^[англ.] функционирует путь Энтнера — Дудорова, все соединения которого находятся в нефосфорилированной форме (нефосфорилированный вариант пути Энтнера — Дудорова). При этом альдольному расщеплению подвергается 2-кето-3-дезоксиглюконат, расщепляющийся на пируват и глицеральдегид. Глицеральдегид окисляется до глицерата, который фосфорилируется до 2-фосфоглицерата, который, в свою очередь, превращается в пируват с промежуточным образованием фосфоенолпирувата. При этом выход АТФ отсутствует, так как АТФ, синтезированный при субстратном фосфорилировании в пируваткиназной реакции, расходуется на активацию глицерата^[6][3]. Возможно, необычный путь Энтнера — Дудорова у этих организмов связан с их экстремофильным образом жизни^[14].

Эволюция

Среди учёных нет единого мнения, какой из механизмов окисления глюкозы (гликолиз или путь Энтнера — Дудорова) появился раньше. Прежде считалось, что о большей древности гликолиза свидетельствует его чрезвычайно широкое распространение среди всех клеточных форм жизни. Однако сейчас, когда очевидно, что путь Энтнера — Дудорова также распространён очень широко, этот аргумент уже не может быть принимаем в расчёт. В пользу большей древности пути Энтнера — Дудорова говорит то, что он встречается у некоторых примитивных бродильщиков (Zymomonas mobilis). Более того, существование модификаций пути Энтнера — Дудорова, в которых превращениям подвергаются нефосфорилированные соединения, указывает на то, что, возможно, он использовался первыми на Земле бродильщиками^[3].

Существует также точка зрения, что путь Энтнера — Дудорова развивался вместе с аэробным дыханием и циклом Кребса как средство для быстрого образования пирувата из сахаров. Но присутствие пути Энтнера — Дудорова у облигатных бродильщиков (Zymomonas mobilis) и облигатных анаэробов (клостридии) ставит под сомнение и такое предположение^[3].

Биотехнологическое применение

В настоящее время путь Энтнера — Дудорова начинают использовать в биотехнологии для выработки или повышения эффективности образования ряда полезных соединений. Так, в 2015 году была опубликована работа, в которой сообщалось об успешном внедрении дополнительных ферментов этого пути из клеток Zymomonas mobilis в клетки E. coli. В результате эффективность образования НАДФ٠Н в ходе этого пути увеличилась в 25 раз. НАДФ٠Н служит кофактором в биосинтезе ряда ценных соединений, таких как изопреноиды, производные жирных кислот и биополимеры, поэтому способы повышения образования НАДФ٠Н имеют важное биотехнологическое значение^[15]. В другой работе путь Энтнера — Дудорова вместе с путём дезаминирования серина и пируватдегидрогеназным комплексом был использован для улучшения выработки поли-3-гидроксибутирата^[англ.] (биоразлагаемого биопластика) клетками E. coli^[16]. Сочетание пути Энтнера — Дудорова с 2-C-метил-D-эритриол-4-фосфатным путём позволяет увеличить образование изопрена в генно-модифицированных клетках E. coli^[17].

Примечания

1. Нетрусов, Котова, 2012, с. 123.
2. Нетрусов, Котова, 2012, с. 123, 127.
3. Conway T. The Entner-Doudoroff pathway: history, physiology and molecular biology. (англ.) // FEMS microbiology reviews. — 1992. — Vol. 9, no. 1. — P. 1—27. — PMID 1389313. [исправить]
4. The Entner-Doudoroff Pathway  (неопр.). Дата обращения: 13 июля 2014. Архивировано из оригинала 14 июля 2014 года.
5. Нетрусов, Котова, 2012, с. 127.
6. Современная микробиология, 2005, с. 265.
7. Willey et. al., 2009, p. 194.
8. Klingner A., Bartsch A., Dogs M., Wagner-Döbler I., Jahn D., Simon M., Brinkhoff T., Becker J., Wittmann C. Large-Scale 13C flux profiling reveals conservation of the Entner-Doudoroff pathway as a glycolytic strategy among marine bacteria that use glucose. (англ.) // Applied and environmental microbiology. — 2015. — Vol. 81, no. 7. — P. 2408—2422. — doi:10.1128/AEM.03157-14. — PMID 25616803. [исправить]
9. Patra T., Koley H., Ramamurthy T., Ghose A. C., Nandy R. K. The Entner-Doudoroff pathway is obligatory for gluconate utilization and contributes to the pathogenicity of Vibrio cholerae. (англ.) // Journal of bacteriology. — 2012. — Vol. 194, no. 13. — P. 3377—3385. — doi:10.1128/JB.06379-11. — PMID 22544275. [исправить]
10. Schatschneider S., Huber C., Neuweger H., Watt T. F., Pühler A., Eisenreich W., Wittmann C., Niehaus K., Vorhölter F. J. Metabolic flux pattern of glucose utilization by Xanthomonas campestris pv. campestris: prevalent role of the Entner-Doudoroff pathway and minor fluxes through the pentose phosphate pathway and glycolysis. (англ.) // Molecular bioSystems. — 2014. — Vol. 10, no. 10. — P. 2663—2676. — doi:10.1039/c4mb00198b. — PMID 25072918. [исправить]
11. Fabris M., Matthijs M., Rombauts S., Vyverman W., Goossens A., Baart G. J. The metabolic blueprint of Phaeodactylum tricornutum reveals a eukaryotic Entner-Doudoroff glycolytic pathway. (англ.) // The Plant journal : for cell and molecular biology. — 2012. — Vol. 70, no. 6. — P. 1004—1014. — doi:10.1111/j.1365-313X.2012.04941.x. — PMID 22332784. [исправить]
12. Benisch F., Boles E. The bacterial Entner-Doudoroff pathway does not replace glycolysis in Saccharomyces cerevisiae due to the lack of activity of iron-sulfur cluster enzyme 6-phosphogluconate dehydratase. (англ.) // Journal of biotechnology. — 2014. — Vol. 171. — P. 45—55. — doi:10.1016/j.jbiotec.2013.11.025. — PMID 24333129. [исправить]
13. Ahmed H., Ettema T. J., Tjaden B., Geerling A. C., van der Oost J., Siebers B. The semi-phosphorylative Entner-Doudoroff pathway in hyperthermophilic archaea: a re-evaluation. (англ.) // The Biochemical journal. — 2005. — Vol. 390, no. Pt 2. — P. 529—540. — doi:10.1042/BJ20041711. — PMID 15869466. [исправить]
14. Liu T., Shen Y., Liu Q., Liu B. The unique Entner-Doudoroff (ED) glycolysis pathway of glucose in archaea--a review (кит.) // Wei sheng wu xue bao = Acta microbiologica Sinica. — 2008. — Vol. 48, 第8数. — P. 1126—1131. — PMID 18956766. [исправить]
15. Ng C. Y., Farasat I., Maranas C. D., Salis H. M. Rational design of a synthetic Entner-Doudoroff pathway for improved and controllable NADPH regeneration. (англ.) // Metabolic engineering. — 2015. — Vol. 29. — P. 86—96. — doi:10.1016/j.ymben.2015.03.001. — PMID 25769287. [исправить]
16. Zhang Y., Lin Z., Liu Q., Li Y., Wang Z., Ma H., Chen T., Zhao X. Engineering of Serine-Deamination pathway, Entner-Doudoroff pathway and pyruvate dehydrogenase complex to improve poly(3-hydroxybutyrate) production in Escherichia coli. (англ.) // Microbial cell factories. — 2014. — Vol. 13. — P. 172. — doi:10.1186/s12934-014-0172-6. — PMID 25510247. [исправить]
17. Liu H., Sun Y., Ramos K. R., Nisola G. M., Valdehuesa K. N., Lee W. K., Park S. J., Chung W. J. Combination of Entner-Doudoroff pathway with MEP increases isoprene production in engineered Escherichia coli. (англ.) // Public Library of Science ONE. — 2013. — Vol. 8, no. 12. — P. e83290. — doi:10.1371/journal.pone.0083290. — PMID 24376679. [исправить]

Литература

Книги

• Нетрусов А. И., Котова И. Б. Микробиология. — 4-е изд., перераб. и доп.. — М.: Издательский центр «Академия», 2012. — 384 с. — ISBN 978-5-7695-7979-0.
• Современная микробиология / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. — М.: Мир, 2005. — Т. 1. — 654 с.
• Joanne M. Willey, Linda M. Sherwood, Christopher J. Woolverton. Prescott's Principles of Microbiology. — 1st edition. — McGraw-Hill Higher Education, 2009. — P. 105—106. — 968 p. — ISBN 978-0-07-337523-6.

Статьи

• Richhardt J., Bringer S., Bott M. Role of the pentose phosphate pathway and the Entner-Doudoroff pathway in glucose metabolism of Gluconobacter oxydans 621H. (англ.) // Applied microbiology and biotechnology. — 2013. — Vol. 97, no. 10. — P. 4315—4323. — doi:10.1007/s00253-013-4707-2. — PMID 23354449. [исправить]
• Rutkis R., Kalnenieks U., Stalidzans E., Fell D. A. Kinetic modelling of the Zymomonas mobilis Entner-Doudoroff pathway: insights into control and functionality. (англ.) // Microbiology (Reading, England). — 2013. — Vol. 159, no. Pt 12. — P. 2674—2689. — doi:10.1099/mic.0.071340-0. — PMID 24085837. [исправить]
• Chavarría M., Nikel P. I., Pérez-Pantoja D., de Lorenzo V. The Entner-Doudoroff pathway empowers Pseudomonas putida KT2440 with a high tolerance to oxidative stress. (англ.) // Environmental microbiology. — 2013. — Vol. 15, no. 6. — P. 1772—1785. — doi:10.1111/1462-2920.12069. — PMID 23301697. [исправить]