Di Santo startet karrieren hos sin lokale klubb Godoy Cruz i 2005, og var der bare èn sesong før han flyttet til Audax Italiano. I 2006/2007 sesongen scoret han 16 mål på 69 kamper for klubben. Mot slutten av sesongen ble flere toppklubber interessert i spissen, blant andre Chelsea, Manchester United og Real Madrid. Overgangen fra Audax Italiano til Chelsea ble fullført den 25. januar 2008 da han signerte en fire og et halvt års kontrakt.
Den 14. august 2013 skrev han under for den tyske toppklubben Werder Bremen på en treårskontrakt.