二本鎖DNA分子を妥当な制限部位 （英語版 ） 制限酵素 （エンドヌクレアーゼ）Hind III ヌクレアーゼ （英 : nuclease ）は、核酸 のヌクレオチド 間のホスホジエステル結合 を切断することができる酵素 である。古くはヌクレオデポリメラーゼ （英 : nucleodepolymerase ）またはポリヌクレオチダーゼ （英 : polynucleotidase ）とも呼ばれた。ヌクレアーゼは、標的分子 の一本鎖 および二本鎖 をさまざまな様式で切断する。ヌクレアーゼは、生体内におけるDNA修復 に関わる多くの側面で不可欠な機構である。ある種のヌクレアーゼの欠陥は、遺伝的不安定性 や免疫不全 を引き起こす可能性がある[ 1] 分子クローニング （英語版 ） [ 2]
ヌクレアーゼは、その活性座位 によって2種類に大別される。エキソヌクレアーゼ (en:英語版 ) は、核酸を末端から消化する。エンドヌクレアーゼ (en:英語版 ) は、標的分子の途中 にある領域に作用する。これらはさらに、デオキシリボヌクレアーゼ とリボヌクレアーゼ に分類できる。前者はDNA に作用し、後者はRNA に作用する[ 2]
1960年代後半、科学者のスチュアート・リンとヴェルナー・アーバー は、大腸菌 （E. coli ）でのファージ 増殖制限に関与する2種類の酵素の標本を単離した[ 3] [ 4] メチル基 を付加してメチル化DNA を生成し、他方は非メチル化DNAを分子の長さ方向に沿ったさまざまな場所で切断した。最初の種類の酵素は「メチラーゼ 」、もう一方は「制限ヌクレアーゼ 」と呼ばれた。DNA分子を「切り貼り 」するための必要な道具を集めていた科学者にとって、これらの酵素学的な道具は重要であった。そこで必要とされたのが、分子の長さに沿ったランダム な位置ではなく、特定の部位でDNAを切断し、科学者が予測可能かつ再現性のある方法でDNA分子を切断できる道具であった。
1968年、ジョンズ・ホプキンス大学 で研究していたハミルトン・スミス 、K・W・ウィルコックス、トーマス・J・ケリー （英語版 ） ヌクレオチド 配列に依存して機能する最初の制限酵素 を単離し、その特徴を明らかにしたとき、重要な進展がもたらされた。このグループは、インフルエンザ菌 を使った研究で、6つの塩基対からなる特定の配列内の特定の位置で常にDNA分子を切断するHind IIと呼ばれる酵素を単離した。彼らは、Hind II酵素が常にその配列の中心（3番目と4番目の塩基対の間）を直接切断することを発見した。
ほとんどのヌクレアーゼは、「国際生化学・分子生物学連合 命名法委員会」のEC番号 によって、加水分解酵素（ヒドロラーゼ） （EC番号3）として分類されている。ヌクレアーゼは、ホスホジエステラーゼ 、リパーゼ 、およびホスファターゼ と同様に、加水分解酵素のサブグループであるエステラーゼ（EC番号3.1）に属する。ヌクレアーゼが属するエステラーゼは、EC番号3.1.11 - EC番号3.1.31に分類される。
ヌクレアーゼの一次構造 は、最小限の活性部位 が保存 される他は大部分が保存されておらず、その表面は主に、酸性および塩基性のアミノ酸残基 から構成されている。ヌクレアーゼはフォールディングファミリーに分類される[ 5]
DNAと複合体を形成したEcoRVの結晶構造[ 6]
ヌクレアーゼは、核酸分子を切断する前に、核酸と結合しなければならない。それには、ある程度の認識が必要となる。ヌクレアーゼは、その認識と結合の様式において、特異的 および非特異的な結合の両方をさまざまに用いる。どちらの様式も、生存生物内、特にDNA修復において重要な役割を果たしている[ 7]
DNA修復 に関与する非特異的エンドヌクレアーゼは、DNAを走査して標的配列 （英語版 ） 損傷 （英語版 ） 活性部位 の残基 はDNAの化学基と相互作用する。Eco RVBam HI（英語版 ） 最小表面積 （英語版 ） B型構造 のままとなる[ 7]
これに対し、部位特異的ヌクレアーゼは、はるかに強い結合を形成し、DNAをそのDNA結合ドメイン の深い溝に引き込む。これによりDNAの三次構造 が大きく変形し、塩基性 （正電荷を持つ）の残基を多く含む表面が実現される。それはDNAとの広範な静電的相互作用に関与する[ 7]
DNA修復に関与するヌクレアーゼの中には、部分的な配列特異性を示すものがある。ただし、ほとんどは非特異的で、塩基対 の不一致によってDNA骨格 に生じた構造異常を認識する[ 7]
詳細については、フラップエンドヌクレアーゼ （英語版 ）
酵素
起源
認識する配列
切断位置
Hind IIインフルエンザ菌 Haemophilus influenzae )
5'–GTYRAC–3'
5'–GTY RAC –3'CAR YTG –5'
R = A or G ; Y = C or T
Hind IIの発見以来、230以上の菌株から900種類以上の制限酵素が単離され、中には配列特異的なものも、そうではないものもある。これらの制限酵素には、一般にその起源を反映した名前がつけられる。名前の最初の文字は属名に由来し、次の2文字は、それらが単離された原核細胞 の種名に由来する。たとえば、Eco RIEscherichia coli RY13（大腸菌 RY13株）に由来し、Hind IIはHaemophilus influenzae strain Rd（インフルエンザ菌 Rd株）に由来する。ヌクレアーゼ名に続く数字は、その酵素が単一菌株から単離された順序を示す（例：Eco RI、Eco RII
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子を長さ方向に沿って「走査」することで機能を果たす。それは、特定の認識配列に遭遇するとDNA分子に結合し、2つの糖-リン酸主鎖 をそれぞれ1つずつ切断する。この2つの切断の位置は互いに関連し、また認識配列自体にも関連しており、制限エンドヌクレアーゼの独自性によって決定される。エンドヌクレアーゼが異なれば切断の仕方も異なるが、特定のエンドヌクレアーゼは、作用するDNA分子に関わらず、特定の塩基配列を常に同じように切断する。切断が行われると、DNA分子は断片に分割される。
すべての制限エンドヌクレアーゼが、上記のHind IIのように対称的に切断し、平滑末端を残すわけではない。多くのエンドヌクレアーゼは、互いに正対しない位置でDNA主鎖を切断し、オーバーハングを形成する。たとえば、ヌクレアーゼEcoRIの認識配列は5'—GAATTC—3'である。
酵素
起源
認識する配列
切断位置
Hind IIIインフルエンザ菌 Haemophilus influenzae )
5'–AAGCTT–3'
5'–A AGCTT –3'TTCGA A –5'
Eco RI大腸菌 Escherichia coli )
5'–GAATTC-3'
5'–G AATTC –3'CTTAA G –5'
Bam HI（英語版 ） バチルス・アミロリケファシエンス （英語版 ） Bacillus amyloliquefaciens )
5'–GGATCC–3'
5'–G GATCC –3'CCTAG G –5'
酵素はこの配列に遭遇すると、G A 水素結合 によってのみ保持される。この結合の弱さは、DNA断片が互いに分離することを可能にする。得られた各断片には、不対塩基からなる突出した5'末端がある。別の酵素は、DNA骨格に切れ目を作り、3' 末端が突出する。突出した末端（3' と 5' ともに）は、塩基の相補的な配列と結合する傾向があり、そのために「粘着末端 （英語版 ） 5'—AATT—3'が別の不対配列3'—TTAA—5'に遭遇すると、互いに結合する。これらは互いに粘着性を持つ。次にリガーゼ と呼ばれる酵素が用いられて、2つの分子のリン酸骨格を結合する。粘着末端の細胞由来、あるいは種由来でさえ、その粘着性に影響を与えない。たとえ配列の一方がヒトDNA に由来し、もう一方が細菌 DNAに由来する場合でも、相補的配列の任意の組は結合する傾向がある。実際、この粘着性の性質によって、異なる起源のDNAから構成される組換えDNA 分子の作成が可能となり、遺伝子工学 技術が誕生した。
すべての細胞は遺伝情報 の媒体としてDNAに依存しているため、遺伝子の品質管理はすべての生物にとって不可欠な機能である。DNAの複製 は誤りが起こりやすい過程であり、DNA分子自体も、多くの代謝的あるいは環境的要因のストレスを受けやすい。身近な例として、活性酸素種 、近紫外線 、あるいは電離放射線 があげられる。多くのヌクレアーゼは、損傷部位を認識し、それを周囲のDNAから切断することでDNA修復に関与する。これらの酵素は単独で、あるいは複合体 として機能する。DNA修復に関与するほとんどのヌクレアーゼは配列特異的ではない。これらは二本鎖DNA（dsDNA）の二次構造の変形を通じて損傷部位を認識する[ 5]
DNAの複製 中に、DNAポリメラーゼ は、相補的な鋳型鎖に対して新しいDNA鎖を伸長 させる。ほとんどのDNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ と校正 エキソヌクレアーゼ という2つの異なる酵素 的なドメイン から構成されている。ポリメラーゼは、新しい鎖を 5'→3' 方向に伸長させる。エキソヌクレアーゼは、同じ鎖から誤ったヌクレオチドを 3'→5' 方向に除去する。このエキソヌクレアーゼ活性は、DNAポリメラーゼが校正を行うために不可欠である。これらのヌクレアーゼを不活性化したり失ったりする欠失 は、影響を受けた微生物 の突然変異率や死亡率を増加させ、マウス では発癌 率を増加させる[ 8]
DNA損傷 の多くの形態は複製フォーク の進行を停止させ、DNAポリメラーゼや関連する仕組みがそのフォークを放棄する原因となる。その時、これはフォーク固有のタンパク質によって処理する必要がある。最も有名な酵素はMUS81 （英語版 ） 酵母 において、その欠失は減数分裂 の欠陥に加え、紫外線またはメチル化損傷感受性を引き起こす[ 5]
細胞内では、岡崎フラグメント RNAプライマー を複製から除去する仕事が広範に行われている。このようなプライマーの多くは、RNase H ファミリーのエンドヌクレアーゼによって、新たに合成されたラギング鎖 DNAから切り出される。また、真核生物 や古細菌 では、フラップエンドヌクレアーゼ （英語版 ） FEN1 （英語版 ） [ 5]
既知の生物におけるDNAミスマッチ修復 は、一連のミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼによって行われる。原核生物では、この役割は主にMutSLHと超短鎖パッチ修復 （英語版 ）
MutSLHシステム（MutS （英語版 ） 点変異 と小ターン 変異を修正する。MutSはミスマッチを認識して結合し、ここでMutLとMutHを動員する。MutLは、MutSとMutHの相互作用を仲介し、MutHのエンドヌクレアーゼ活性を高める。MutHは、ヘミメチル化された5'—GATC—3'部位を認識し、非メチル化鎖（最近合成された鎖）のGの隣で切断する。
VSP修復はエンドヌクレアーゼVsrによって開始される。Vsrは、メチル化 シトシンのチミンへの自発的な脱アミノ化 によって起こる特定のT/Gミスマッチを修正する。Vsrは配列5'—CT W GG—3'を認識し、ミスマッチしたチミンの 5' 側のDNA鎖にニック （切れ目）を入れる（前出の配列で下線が引かれている）。次に、エキソヌクレアーゼRecJ、ExoVII 、またはExoI のいずれかが、DNAポリメラーゼが鎖のギャップを再合成する前に、この部位を分解する[ 5]
AP部位 （英語版 ） 塩基除去修復 の中間段階として、自然加水分解とDNAグリコシラーゼ の活性によって生じる。これらのAP部位は、APエンドヌクレアーゼ （英語版 ） [ 5]
ヌクレオチド除去修復 は、損傷したヌクレオチドを除去し置き換えることである。これを前述の塩基除去修復と混同してはならない。架橋 、付加体 （英語版 ） 損傷 （紫外線や活性酸素 によって生じる）の例は、その修復経路の引き金となりうる。そのような損傷を受けたヌクレオチドを含む一本鎖DNAの短い区間は、損傷個所の上流と下流にニックを入れる別々のエンドヌクレアーゼによって二重鎖DNAから除去される。これらのヌクレアーゼに影響を与える欠失や突然変異は、紫外線による損傷あるいは発癌に対する感受性を高める。このような異常は、神経の発達にさえ影響を与えることもある。
細菌では、UvrB-UvrC （英語版 ） XPG （英語版 ） XPF -ERCC1 が同じようにそれぞれのニックに作用する[ 9]
細胞内では、二重鎖切断 が、意図的または非意図的にかかわらず定期的に行われる。意図的でない切断は、通常、電離放射線 、さまざまな外因性や内因性の化学物質、および複製フォークの停止によって発生する。意図的な切断は、減数分裂やV(D)J組換え の中間体として生成され、主に相同組換え や非相同末端結合 によって修復される。どちらの場合も、修復が行われる前に、二本鎖切断の末端がヌクレアーゼによって処理される必要がある。そのようなヌクレアーゼの一つに、Rad50 と複合体化したMre11 がある。Mre11の変異は、毛細血管拡張性運動失調症 様疾患を引き起こすことがある[ 9]
V(D)J組換えでは、二本鎖切断に関連するステムループ 構造を開き、その後に両端を結合させることが含まれる。アルテミス-DNAPKcs 複合体 （英語版 ） DNA-PKcs との複合体形成により、ステムループをエンドヌクレアーゼ的に処理することが可能となる。いずれかのタンパク質の欠陥は、重度の免疫不全を引き起こす[ 9]
一方、相同組換えには、Dループ またはホリデイジャンクション で接続された2つの相同DNA二重鎖 (en:英語版 ) が含まれる。細菌では、RuvC （英語版 ） Cce1 （英語版 ） Ydc2 （英語版 ） ミトコンドリア 内でホリデイジャンクションを処理する[ 9]
特定のヌクレアーゼが特定のDNA分子を切断する頻度は、DNAの複雑さとヌクレアーゼの認識配列の長さに依存する。偶然に特定の順序で塩基が見つかる統計的可能性のため、認識配列が長くなると切断の頻度は低くなる。たとえば、特定の4塩基配列（仮想的なヌクレアーゼの認識部位に相当）は、平均して256塩基対ごとに出現すると予測されるが（4^4=256）、任意の6塩基配列は平均して4096塩基対ごとに1回出現すると予測される（4^6=4096）。
ヌクレアーゼの独特なファミリーの1つにメガヌクレアーゼ （英語版 ） ゲノム工学 への応用に特に有用である。一般に、数十億塩基対に及ぶ大きなゲノムは、従来のヌクレアーゼでは頻繁で有害な部位特異的切断を引き起こす。
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