Tim Drake/Robin: personaggio giocabile sia in modalità storia che modalità sfida. Non presente nella versione per Game Boy Advance. Doppiatore: Scott Menville.
Barbara Gordon/Batgirl: personaggio giocabile sia in modalità storia che modalità sfida. Non presente nella versione per Game Boy Advance. Doppiatrice: Tara Strong.
Dick Grayson/Nightwing: personaggio giocabile sia in modalità storia che modalità sfida. Non presente nella versione per Game Boy Advance. Doppiatore: Loren Lester.
James Gordon: è di supporto a Batman tramite Batcomunnicator. Verrà rapito dallo Spaventapasseri nella fase iniziale del videogioco. Il Cavaliere Oscuro dovrà salvarlo. Doppiatore: Bob Hastings.
Nemici/Boss
Sin Tzu: antagonista principale del gioco, un supercriminale cinese arrivato a Gotham City per sfidare Batman, da lui ritenuto un degno avversario. Personaggio inedito. Doppiatore: Cary-Hiroyuki Tagawa.
Matt Hagen/Clayface: non notando, dal suo punto di vista, alcun interesse da parte degli scienziati a trovare una cura per il suo stato, sta trasformando dei civili in argilla, in modo da rafforzare il problema e costringerli così a cercare una cura. Doppiatore: Ron Perlman.
Bane: creduto da Batman una bomba, il Cavaliere Oscuro porterà la nave contenente la cassa in cui è nascosto nella Batcaverna per poterla disinnescare. A quel punto Bruce scoprirà che non si tratta di una bomba... Doppiatore: Héctor Elizondo.
Altri nemici
Tirapiedi dello Spaventapasseri: semplici criminali di strada, alcuni possono scagliare a terra una bomba contenente la tossina dello Spaventapasseri, che può provocare delle allucinazioni a Batman.
Creature di Clayface: civili trasformati da Clayface in creature argillose.
Mercenari: criminali che favoriscono l'arrivo di Bane a Gotham City.
Tirapiedi di Sin Tzu: criminali esperti in arti marziali. Alcuni sono in grado di generare una sfera di energia mistica, che se scagliata contro Batman, potrà confonderlo.
Altri personaggi
Il Joker: rinchiuso nell'Arkham Asylum, in seguito agli eventi di Batman: Vengeance, è stato paralizzato temporaneamente da Sin Tzu.
Harleen Quinzel/Harley Quinn: rinchiusa nell'Arkham Asylum, in seguito agli eventi di Batman: Vengeance, è stata paralizzata temporaneamente da Sin Tzu.
Victor Fries/Mr. Freeze: rinchiuso nell'Arkham Asylum, in seguito agli eventi di Batman: Vengeance, è stato paralizzato temporaneamente da Sin Tzu.
Pamela Isley/Poison Ivy: rinchiusa nell'Arkham Asylum, in seguito agli eventi di Batman: Vengeance, è stata paralizzata temporaneamente da Sin Tzu.
Civili: persone che vengono attaccate dai vari criminali. Batman dovrà salvarli prima dello scadere del tempo.
