Vikariat Apostolik Puerto Ayacucho (bahasa Latin: Apostolicus Vicariatus Portus Ayacuquensis) adalah sebuah wilayah pelayanan Gereja Katolik Roma. Tahta katedralnya, Catedral María Auxiliadora, terletak di kota Puerto Ayacucho, negara bagian Amazonas, Venezuela. Wilayah gerejawi tersebut adalah subyek langsung dari Tahta Suci dan bukan bagian dari provinsi gerejawi manapun.
Pada 5 Februari 1932, Paus Pius XI mendirikan Prefektur Apostolik Alto Orinoco dari wilayah yang saat itu diambil dari Keuskupan Santo Tomás de Guayana (yang kemudian menjadi Keuskupan Agung Metropolitan Ciudad Bolívar).
Wilayah gerejawi tersebut ditingkatkan menjadi Vikariat Apostolik dan Paus Pius XII memberikannya nama saat ininya pada 7 Mei 1953.[1][2]