A transcriptase inversa,[2][3]reversotranscriptase ou retrotranscriptase (RT) é un encima utilizado para xerar unha copia de ADN complementario (ADNc) a partir dun molde de ARN, proceso chamado transcrición[4] inversa, reversotranscrición ou retrotranscrición. A transcrición inversa (ARN→ADN) é o proceso inverso da transcrición (ADN→ARN). A transcriptase inversa é necesaria para a replicación dos retrovirus (por exemplo o VIH), e os inhibidores da transcriptase inversa son drogas antirretrovirais moi utilizadas no tratamento do VIH/SIDA. Nos eucariotas existen tamén encimas con actividade de transcriptase inversa que interveñen na replicación dos extremos dos cromosomas (telomerase) e dalgúns elementos xenéticos móbiles (retrotransposóns). Tamén se encontrou actividade de transcriptase inversa nas bacterias nos chamados Retron msr RNAs.
A transcriptase inversa retroviral presenta tres actividades bioquímicas secuenciais:
ADN polimerase ARN dependente. A patir dun molde de ARN fai unha copia complementaria de ADN.
ADN polimerase ADN dependente. A partir dun molde de ADN fai unha copia complementaria tamén de ADN.
Estas tres actividades úsanas os retrovirus para converter o seu ARN monocatenario xenómico en ADN bicatenario, que se pode integrar no xenoma do hóspede, xerando potencialmente unha infección de longa duración difícil de erradicar. A mesma secuencia de reaccións é moi usada no laboratorio para converter ARN en ADN para usalo na clonación molecular, secuenciación do ARN, reacción en cadea da polimerase (PCR), ou análise xenómica.
Transcriptases inversas que foron ben estudadas son:
Transcriptase inversa do VIH-1 (virus da inmunodeficiencia humana 1) (PDB - 1HMV).
Transcriptase inversa do M-MLV (virus da leucemia murina|virus da leucemia murina Moloney.
Transcriptase inversa do AMV (virus da mieloblastose animal).
Transcriptase inversa da telomerase (mantén os telómeros dos cromosomas eucarióticos).
A idea da reversotranscrición foi ao principio impopular entre os científicos porque contradicía o dogma central da bioloxía molecular, que establecía que o ADN se transcrbía a ARN e este se traducía a proteínas. Porén, en 1970 cando os científicos Howard Temin e David Baltimore descubriron o encima responsable da reversotranscrición, a posibilidade de que a información xenética puidese fluír desta maneira foi finalmente aceptada.[7]
Función nos virus
O encima está codificado nos virus que realizan a reversotranscrición, que utilizan o encima durante a súa replicación. Os virus de ARN que fan a reversotranscrición, como os retrovirus, usan o encima para reversotranscribir o seu xenoma de ARN a ADN, que é despois integrado no xenoma da súa célula hóspede e replicado ao replicarse este. O VIH é outro virus de ARN que infecta aos humanos grazas ao uso deste encima, e sen el o xenoma viral non podería incorporarse á célula hóspede e non se podería replicar. Existen tamén virus de ADN que fan a reversotranscrición, como os hepadnavirus, nos que o ARN pode servir como molde na ensamblaxe, e para facer cadeas de ADN.
Proceso da reversotranscrición
A transcriptase inversa realiza a reversotranscrición ou transcrición inversa, que consite en formar ADN monocatenario a partir dun molde de ARN.
Os Retroviridae ademais poden facer despois a ese ADN bicatenario. Nas especies de virus que teñen transcriptase inversa pero que carece da actividade de ADN polimerase ADN dependente, a formación de ADN bicatenario pode realizala a ADN polimerase δ codificada no xenoma do hóspede, que tomará o híbrido de ADN-ARN viral como primer (cebador) e sintetizará un ADN de dobre cadea por un mecanismo similar ao da eliminación do primer, no que o ADN acabado de sintetizar despraza o molde de ARN orixinal.
O proceso da reversotranscrición tende a cometer moitos erros de copia e durante esta fase poden orixinarse moitas mutacións. Tales mutacións poden dar lugar a resistencia ás drogas antirretrovirais.
Transcrición inversa retroviral
Os retrovirus, tamén chamados virus ssRNA-RT de clase VI, son virus de ARN que fan a transcrición inversa cun intermediato de ADN. Os seus xenomas constan de dúas moléculas de ARN monocatenario (ssRNA) de sentido positivo que posúen extremos 5' cap e 3' poliA. Exemplos de retrovirus son o virus da inmunodeficiencia humana (HIV) e o virus T linfotrópico humano (HTLV). A creación de ADN de dobre cadea ten lugar no citosol.[8]
Rexións xénicas no ARN viral
Para entendermos mellor as fases que debe seguir o proceso de reversotranscrición veremos primeiro as rexións de que consta o xenoma retroviral. Este ten os xenes codificantes no centro, e as partes importantes para o funcionamento da transcriptase inversa están nos dous extremos. O ARN retroviral ten un extremo 5' e outro 3'. O sitio onde o primer se une (alinea ou anneals) ao ARN viral chámase sitio de unión ao primer (PBS). O extremo 5’ do ARN no sitio PBS denomínase U5, e o extremo 3' do ARN do PBS chámase líder. Utilízase un primer unido a un ARNt celular. O primer de ARNt está desenrolado ao longo de 14 a 22 nucleótidos e forma un dúplex cos pares de bases apareadas co ARN viral no PBS. O feito de que o PBS estea localizado preto do extremo 5’ do ARN viral é pouco común porque a transcriptase inversa sintetiza o ADN do extremo 3’ do primer en dirección 5’→3’ (con respecto ao molde de ARN). Por tanto, o primer e a transcriptase inversa deben ser recolocados despois no extremo 3’ do ARN viral. Isto quere dicir, que o encima ten que cambiar dun extremo a outro do ARN molde durante a reversotranscrición. Para realizar este reposicionamento, necesítanse seguir varios pasos e varias actividades encimáticas como a de ADN polimerase, ribonuclease H (RNase H) e desenrolamento de polinucleótidos.[9]
A transcriptase inversa do VIH tamén ten unha actividade de ribonuclease que degrada o ARN viral durante a síntese do ADNc, xunto coa súa actividade de ADN polimerase ADN dependente que copia a cadea sentido ADNc orixinando unha cadea antisentido de ADN, formando así entre as dúas o intermediato de ADN bicatenario viral (ADNv) que se integrará no xenoma da célula.[10]
Fases da reversotranscrición
Esquema da actuación da transcriptase inversa (explicacións no texto).
A actuación da transcriptase inversa faise seguindo unha serie de pasos (ver a imaxe), que son:
Un ARNt celular específico actúa como primer (cebador) e hibrídase cunha parte complementaria do xenoma do virus chamada sitio de unión ao primer ou PBS, preto do extremo 5'.
Despois fórmase ADN complementario sobre as rexións U5 (rexión non codificante) e R (unha secuencia repetida que se encontra a ambos os lados da molécula de ARN) do ARN viral.
Un dominio do encima transcriptase inversa denominado RNAse H degrada o extremo 5’ do ARN, o que elimina as rexións U5 e R do ARN viral.
O primer (que estaba no extremo 5') entón "salta" ao extremo 3’ do xenoma viral e a pequena cadea de ADN acabada de sintetizar hibrídase coa rexión R complementaria do ARN dese outro extremo (como dixemos, hai unha rexión R en cada extremo do ARN).
A pequena cadea de ADN complementario (ADNc) alóngase en dirección ao outro extremo completando a súa síntese, e a maioría do ARN viral é degradado polo dominio RNAse H (só queda a rexión PP).
Unha vez que a primeira cadea de ADN (ADNc) está completa, iníciase a síntese dunha segunda cadea de ADN cara ao extremo 5' do ARN, empezando desde o ARN viral que quedou (rexión PP).
Prodúcese entón outro "salto" cara ao extremo 3' do ARN no que o PBS da segunda cadea se hibrida co PBS complementario da primeira cadea. Libérase o primer/ARNt.
Ambas as cadeas esténdense máis para completar o que lles falta, e orixínase un ADN bicatenario que está en condicións de poder incorporarse ao xenoma do hóspede polo encima vírico integrase.
Como se ve, a creación do ADN de dobre cadea implica a transferencia de cadea, na cal hai unha translocación do curto produto de ADN sintetizado (a partir da síntese inicial de ADN ARN dependente) a rexións molde aceptoras no outro extremo do xenoma viral de ARN, que son despois atinguidas e procesadas pola transcritse inversa na súa actividade de síntese de ADN dependente de ADN.[11]
Certos tramos autorreplicantes dos xenomas eucarióticos chamados retrotransposóns utilizan tamén unha transcriptase inversa para moverse dunha posición do xenoma e inserirse noutra por medio dun intermediato de ARN. Son moi abundantes nos xenomas de plantas e animais.
A telomerase é outro encima con actividade de reverso transcriptase que se encontra en moitos eucariotas, incluíndo os humanos, que leva o seu propio molde de ARN; este ARN utilizase como molde para a replicación do ADN nos extremos (telómeros) dos cromosomas.[12]
En procariotas
As transcriptases inversas tamén se encontran nos Retron msr RNAsbacterianos, que son secuencias específicas de ARN que conteñen unha parte (r) que codifica unha transcriptase inversa, e se usan na síntese de ADNs monocatenatios multicopia (msDNA). Para iniciar a síntese do ADN, necesítase un cebador ou primer. Nas bacterias, o primer sintetízase durante a replicación.[13]
Estrutura
Os encimas transcriptase inversa inclúen unha ADN polimerase ARN dependente e unha ADN polimerase ADN dependente, que funcionan conxuntamente para realizar a transcrición. Ademais da función de transcrición, as transcriptases inversas retrovirais teñen un dominio pertencente á familia das RNase H que é fundamenteal na súa replicación.
Fidelidade da replicación
Durante o ciclo de replicaión dun retrovirus utilízanse diferentes sistemas de replicación. Primeiramente, a transcriptase inversa sintetiza o ADN viral a partir do ARN viral, e despois a partir da cadea de ADN acabada de sintetizar. O segundo proceso de replicación ten lugar cando a célula hóspede replica coa súa ADN polimerase o seu ADN e xunto con el o ADN viral integrado no seu xenoma. Finalmente, a ARN polimerase II transcribe o ADN retroviral a ARN, que será despois traducido e empaquetado nos virións. Por tanto, poden ocorrer mutacións durante todos estes pasos de replicación.[14]
A transcriptase inversa ten unha alta taxa de erros á hora de transcribir o ARN a ADN, xa que, a diferenza doutras ADN polimerases, non ten capacidade de corrección de probas. Esta alta taxa de erros permite que se acumulen as mutacións de forma rápida. Por exemplo, as transcriptases inversas dispoñibles comercialmente producidas por Promega teñen, segundo os seus manuais, unha taxa de erro de 1 en 17.000 bases para o AMV e de 1 en 30.000 bases para o M-MLV.[15]
Ademais de orixinaren polimorfismo dun único nucleótido, as transcriptases inversas están implicadas tamén en procesos como a fusión de transcritos, barallamento de exóns (exon shuffling) e na creación de transcritos artificiais antisentido.[16][17] Especulouse que a actividade de cambio de molde da transcriptase inversa, que foi demostrada tanto in vitro coma in vivo, pode ser unha das causas de que se encontren varios miles de transcritos non anotados nos xenomas dos organismos modelos.[18]
Aplicacións
Estrutura molecular da zidovudina (AZT), unha droga usada para inhibir a transcriptase inversa do VIH.
Como o VIH utiliza a transcriptase inversa para copiar o seu material xenético e xerar novos virus, deseñáronse drogas específicas que interrompen este proceso e suprimen o crecemento da infección viral. En conxunto estas drogas chámanse inhibidores da transcriptase inversa e inclúen os análogos de nucleósidos e nucleótidoszidovudina (nome comercial Retrovir), lamivudine (Epivir) e tenofovir (Viread), e tamén inhibidores non análogos de nucleósidos como nevirapina (Viramune).
Bioloxía molecular
A transcriptase inversa úsase correntemente en investigación para aplicar a técnica da reacción en cadea da polimerase ao ARN, o que se denomina reacción en cadea da polimerase con transcriptase inversa (RT-PCR). A técnica da reacción en cadea da polimerase clásica pode aplicarse só ao ADN, pero, coa axuda da transcriptase inversa, o ARN pode transcribirse a ADN, facendo posible a análise por PCR de moléculas de ARN. A transcriptase inversa utilízase tamén para crear librarías de ADNc a partir de ARNm. A dispoñibilidade comercial da transcriptase inversa serviu para aumentar moito o coñecemento na área da bioloxía molecular, xa que, xunto con outros encimas, permitiu aos científicos clonar, secuenciar e caracterizar o ARN.
A transcriptase inversa empregouse tamén na produción de insulina. Ao inserir en bacterias o ARNm eucariótico que codifica a insulina xunto con transcriptase inversa, o ARNm pode integrarse el mesmo no xenoma procariótico, e producir despois grandes cantidades de insulina, o que permitiu abandonar o método usado antes de extracción da insulina do páncreas de porco. Polo contrario, non funcionaría inserir nas bacterias directamente ADN eucariótico (en vez de ARNm) porque é un ADN que contén seccións non cofificantes chamadas intróns, e os seus transcritos non se traducirían con éxito nos ribosomas bacterianos. O ARNm eucariótico madura eliminando os intróns, polo que é máis adecuado para funcionar dentro das células procariotas, as cales carecen de intróns.
↑Temin HM, Mizutani S (1970). "RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus". Nature226 (5252): 1211–3. PMID4316301. doi:10.1038/2261211a0.
↑Baltimore D (1970). "RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses". Nature226 (5252): 1209–11. PMID4316300. doi:10.1038/2261209a0.
↑Telesnitsky A, Goff SP (1993). "Strong-stop strand transfer during reverse transcription". En Skalka, M. A., Goff, S.P. Reverse transcriptase (1st ed.). New York: Cold Spring Harbor. p. 49. ISBN0-87969-382-7.
↑Krieger M, Scott MP, Matsudaira PT, Lodish HF, Darnell JE, Zipursky L, Kaiser C, Berk A (2004). Molecular cell biology. New York: W.H. Freeman and CO. ISBN0-7167-4366-3.
↑Bbenek K, Kunkel AT (1993). "The fidelity of retroviral reverse transcriptases". En Skalka, M. A., Goff, P. S. Reverse transcriptase. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. p. 85. ISBN0-87969-382-7.
↑Zeng XC, Wang SX (2002). "Evidence that BmTXK beta-BmKCT cDNA from Chinese scorpion Buthus martensii Karsch is an artifact generated in the reverse transcription process". FEBS Lett.520 (1-3): 183–4; author reply 185. PMID12044895. doi:10.1016/S0014-5793(02)02812-0.
↑van Bakel H, Nislow C, Blencowe BJ, Hughes TR (2011). "Response to "The Reality of Pervasive Transcription"". PLoS Biology9 (7): e1001102. doi:10.1371/journal.pbio.1001102.
