Née près de Dantzig dans une famille allemande aux origines juives, Charlotte Wolff fait des études de médecine à Fribourg et Berlin. A Fribourg, elle suit les cours de Husserl et Heidegger. Recevant son diplôme de docteur en 1928, elle commence à travailler à Berlin. Elle y découvre l'émergence du mouvement de libération gay et rencontre le sexologue Magnus Hirschfeld.
Elle se fixe définitivement à Londres. Membre de la British Psychological Society, elle écrit de nombreux livres de psychiatrie, en particulier sur l'homosexualité féminine (elle était elle-même lesbienne) et la bisexualité. Ces ouvrages sont fondés sur de nombreux témoignages, considérés avec un respect encore peu habituel. Elle a aussi longuement correspondu avec la romancière Christa Wolf.