Marcello Santacroce wurde am 7. Juni 1619 in Rom als Sohn von Valerio und Elena Maria Santacroce geboren. Er stammt aus einer Familie mit mehreren Kardinälen: Sein Großonkel war Kardinal Prospero Santacroce (1565 erhoben) und sein Onkel war Kardinal Antonio Santacroce (1629 erhoben). Sein Neffe, Andrea Santacroce, wurde 1699 ebenfalls zum Kardinal erhoben. Er studierte Theologie, Griechisch und Latein, bevor er in Rom in Rechtswissenschaften promoviert wurde. Am 14. August 1639 wurde er zum Kanoniker der Vatikanbasilika und später zum Referendar der Tribunale der Apostolischen Signatur, zum Prälaten der Kongregation für die Güterverwaltung, zum Beauftragten für den Frieden unter dem Volk von Rieti, zum Vizelegat von Bologna und zum Generalkommissar der drei Gesandtschaften Bologna, Ravenna und Ferrara ernannt. Danach kehrte er nach Rom zurück, wo er Prälat der Consulta-Kongregation, Generalkommissar der päpstlichen Flotte und Abt von Santa Spirito di Sonnone in Gaeta wurde.
