V zimě následujícího roku byla pozvána do Skotska, kde se konala svatba krále Jakuba V. a francouzské princezny Magdalény z Valois, nejstarší dcery francouzského krále Františka I. Když 9. června1537 Mariin manžel Ludvík Orleánský zemřel, stala se ve věku 21 let vdovou. O dva měsíce později porodila své druhé dítě, syna Ludvíka, který však ve věku čtyř měsíců zemřel.
Nové námluvy
Marie de Guise a Jakub V.
Po smrti Jakubovy manželky Magdalény z Valois se skotský král opět vydal do Francie pro nevěstu. Marie de Guise byla dobrou partií i pro krále, což dokazuje i to, že se o její ruku ucházel i sám Jindřich VIII., čehož hlavním důvodem bylo, aby Jakub nemohl posílit své vztahy s katolickou Francií. Katoličtí Guisovci však dali přednost stejně nábožensky orientovanému Jakubovi.
Marie byla šokovaná, když jí oznámili, že pro ni sjednali nový sňatek. Dosud žila v prosperujícím, téměř luxusním prostředí, a vůbec se jí nechtělo opustit kulturně vyspělejší a krásnější Francii a odjet daleko od své rodiny, do podle ní barbarského a drsného Skotska. Na její nevůli se podepsal i fakt, že uplynul jen krátký čas, co ovdověla a přišla o syna, ale nakonec se podvolila žádosti svého otce. Svatba se konala v květnu 1538 v pařížskémchrámu Notre-Dame, kde si vzala za manžela skotského krále Jakuba V., v zastoupení Roberta, lorda Maxwella.
Druhé manželství
Když Marie v červnu opustila Francii, zanechala doma svého prvorozeného syna, kterého si nesměla s sebou vzít do svého nového domova. Na pobřeží Skotska přistála 10. června1538, a ve Fife ji oficiálně přivítal její manžel Jakub. Marie byla překvapená uvítáním, protože přicházela s přesvědčením, že její nová vlast je barbarská a nekulturní zem. Naproti tomu přinesla Marie do Skotska renesančního ducha, módu i zvyky. Několik dní po Mariině příjezdu se konala svatba ještě jednou, tentokrát se jí ale zúčastnil Jakub osobně, a 22. února1540 byla Marie v Holyroodském opatství korunovaná na skotskou královnu.
22. května1540, jen tři měsíce po korunovaci, přivedla Marie v St. Andrews na svět svého prvního syna – následníka trůnu Jakuba, který však žil jenom rok. 24. dubna1541 porodila druhého syna, Roberta, vévodu z Albany, který ale o dva dny později zemřel rovněž. Další dítě, tentokrát dcera, se narodila 8. prosince1542. Jen několik dní po narození malé Marie Stuartovny se Marie de Guise stala podruhé vdovou, když duševně zlomený Jakub V. zemřel ve svém paláci Falkland.
Královna vdova
Po Jakubově smrti se novou královnou stala jen několikadenní Marie Stuartovna. Protože ještě nebyla schopna sama vládnout, regentkou se stala její matka Marie de Guise. Regentství neproběhlo bez problémů – čím dál víc musela bojovat proti protestantům, které tajně podporovala anglická královna Alžběta I. Marie poslala svou dceru na výchovu na francouzský dvůr, kde měla vyrůstat spolu s dětmi krále Jindřicha II. a následně se stát manželkou Jindřichova syna a budoucího francouzského krále Františka II. Marie nechala dceru v rukou své rodiny de Guise a nepřestávala se zajímat o její pokroky, ale navštívila ji ve Francii pouze jedenkrát. V roce 1559skotskýparlament zbavil Marii regentství.
Zemřela 11. června1560 v Edinburghu na vodnatost. Její tělo bylo převezeno do Francie a pochováno v kostele v ženském klášteře v Remeši, kde byla abatyší její sestra Renée.
