El 3 d'abril de 1497 Margarida es casà a la catedral de Burgos amb el príncep d'AstúriesJoan d'Aragó (1478-1497), únic fill mascle i hereu dels Reis Catòlics, que no obstant això va morir sis mesos després, deixant a Margarida embarassada. Margarida sumida en una profunda tristesa per la mort del seu espòs va donar llum prematurament una nena que no va sobreviure.
Margarida va dirigir amb prudència i saviesa els Països Baixos, actuant com intermediària del seu pare, també va negociar un tractat amb el Regne d'Anglaterra en el qual s'afavoria el comerç de robes flamenques. També va participar en la Lliga de Cambrai de 1508. El 1515 Carles V, un cop aconseguida la seva majoria d'edat, es va rebel·lar breument contra la seva influència, encara que ben aviat la va reconèixer com a consellera sàvia i raonable, tornant a restituir el seu lloc el 1519, intermitentment, fins a la seva mort. Va negociar, al costat de Lluïsa de Savoia, l'anomenada Pau de Cambrai o Pau de les Dames l'any 1529, que posà fi a la Guerra de la Lliga de Cognac.[4]