Microscopiu ópticu

Un microscopiu ópticu ye un microscopiu basáu en lentes óptiques. Tamién se-y conoz como microscopiu de lluz (qu'usa lluz o «fotones») o microscopiu de campu claro. El desenvolvimientu d'esti aparatu suel acomuñase colos trabayos d'Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaben d'una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismu pa suxetar el material que se diba a desaminar (la muestra o espécime). Esti usu d'una única lente convexa conozse como microscopiu simple, nel que s'inclúi la lente, ente otros aparatos ópticos.

Historia

1590: Zacharias Janssen constrúi un microscopiu con dos lentes converxentes.
1611: Johannes Kepler suxer la manera de fabricar un microscopiu compuestu.
1665: Robert Hooke usa un microscopiu compuestu pa estudiar cortes de corchu y describe los pequeños poros en forma de caxelles a los qu'él llamó "célules". Espubliza'l so llibru Micrographia.
1674: Leeuwenhoek informa'l so descubrimientu de protozoarios. Va reparar bacteries per primer vegada nueve años dempués.
1828: W. Nicol desenvuelve la microscopía con lluz polarizao.
1838: Schleiden y Schwann proponen la teoría de la célula y declaren que la célula nucleada ye la unidá estructural y funcional en plantes y animales.
1849: J. Quekett espubliza un tratáu práuticu sobre l'usu del microscopiu.
1876: Abbé analiza los efeutos de la difracción na formación de la imaxe nel microscopiu y amuesa cómo perfeicionar el diseñu del microscopiu.
1881: Retzius describe gran númberu de texíos animales con un detalle que nun foi superáu por nengún otru microscopista de lluz. Nes siguientes dos décades él, Cajal y otros histólogos desenvuelven nuevos métodos de tinción y ponen los fundamentos de l'anatomía microscópica.
1886: Carl Zeiss fabrica una serie de lentes, diseñu d'Abbé que dexen al microscopista resolver estructures nes llendes teóriques de la lluz visible.
1908: Köhler y Siedentopf desenvuelven el microscopiu de fluorescencia.
1930: Lebedeff diseña y constrúi el primer microscopiu d'interferencia.
1932: Zernike inventa'l microscopiu de contraste de fases.
1937: Ernst Ruska y Max Knoll, físicos alemanes, constrúin el primer microscopiu electrónicu.
1952: Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste d'interferencia diferencial pal microscopiu de lluz.

Partes del microscopiu ópticu y les sos funciones

Tubu, cremallera d'enfoque y torniellu macrométricu

Oculares intercambiables de distintos aumentos

1 * Ocular: lente asitiada cerca del güeyu del observador. Capta y amplía la imaxe formada nos oxetivos.

2 * Oxetivu: lente asitiada nel revólver. Amplía la imaxe, ye un elementu vital que dexa ver al traviés de los oculares.

3 * Condensador: lente que concentra los rayos lluminosos sobre la preparación.

4 * Diafragma: regula la cantidá de lluz que llega al condensador.

5 * Focu: dirixe los rayos lluminosos escontra'l condensador.

6 * Tubu: ye la cámara escura que porta l'ocular y los oxetivos. Puede tar xunida al brazu per aciu una cremallera pa dexar l'enfoque.

7 * Revólver: Ye'l sistema que porta los oxetivos de distintos aumentos, y que rota pa poder usar unu o otru, alliniándolos col ocular.

8 * Torniellos macru y micrométricu: Son torniellos d'enfoque, mueven la platina o'l tubu escontra riba y escontra baxo. El macrométricu dexa desplazamientos amplios pa un enfoque inicial y el micrométricu desplazamientos bien curtios, pal enfoque más precisu. Pueden llevar incorporáu un mandu de bloquéu qu'afita la platina o'l tubu a un determináu altor.

9 *Platina: Ye una plataforma horizontal con un furacu central, sobre'l que s'asitia la preparación, que dexa'l pasu de los rayos procedentes de la fonte de llume asitiáu per debaxo. Dos pinces sirven pa retener el portaoxetos sobre la platina y un sistema de cremallera que dexa mover la preparación. Puede tar fixa o xunida al brazu por una cremallera pa dexar l'enfoque.

10 *Brazu: Ye la estructura que suxeta'l tubu, la platina y los torniellos d'enfoque acomuñaos al tubu o a la platina. La xunión cola bas puede ser articulada o fixa.

11 * Base o pie: Ye la parte inferior del microscopiu que dexa qu'ésti se caltenga de pies.

Sistema de llume

La fonte de lluz (1), cola ayuda d'una lente (o sistema) (2), llamada coleutor, represéntase nel planu del diafragma iris d'abertura (5) del condensador (6). Esti diafragma instálase nel planu focal anterior del condensador (6) y puede variar la so abertura numbérica. El diafragma iris (3) dispuestu xunto al colector (2) ye'l diafragma de campu. La variación del diámetru de la diafragma de campu dexa llograr la so imaxe igual al campu visual llinial del microscopiu. L'abertura numbérica del condensador (6) perpasa, xeneralmente la de l'abertura del oxetivu microscópicu: ye'l llume que dexa ver meyor lo que queremos reparar como les célules o les membranes celulares ente otros.

Microscopiu ópticu compuestu

Un microscopiu compuestu ye un microscopiu ópticu con más d'una lente. Úsense especialmente pa desaminar oxetos tresparentes, o tayaos en llámines tan fines que se trensparenten.

Principales elementos d'un microscopiu básicu

Los microscopios d'esti tipu avecen a ser más complexos, con delles lentes nel oxetivu como nel ocular. L'oxetivu d'estes lentes ye'l d'amenorgar l'aberración cromática y l'aberración esférica. Nos microscopios modernos l'espeyu sustitúise por una llámpara qu'ufre un llume estable y controlable.

Los microscopios compuestos úsense pa estudiar especímenes delgaos, yá que la so fondura de campu ye bien llindada. Polo xeneral, úsense pa desaminar cultivos, preparaciones esmagayaes o una llámina bien fina del material que sía. De normal depende de la lluz que traviese la muestra dende embaxo y davezu son necesaries téuniques especiales p'aumentar el contraste de la imaxe.

La resolución de los microscopios ópticos ta acutáu por un fenómenu llamáu difracción que, dependiendo de l'apertura numbérica (AN o $A_{N}$ ) del sistema ópticu y el llonxitú d'onda de la lluz usada ( $\lambda$ ), afita una llende definida ( $d$ ) al resolución óptica. Suponiendo que les aberraciones óptiques fueren despreciables, el resolución sería:

\delta ={\frac {\lambda }{2*A_{N}}}

De normal, supónse una $\lambda$ de 550 nm, correspondiente a la lluz verde. Si'l mediu ye'l aire, la $A_{N}$ práutica máxima ye de 0,95, y nel casu d'aceite d'hasta 1,5.

Ello implica qu'inclusive'l meyor microscopiu ópticu ta llindáu a una resolución d'unos 0,2 micrómetros.

Poder separtador, oxetivos d'inmersión y aumentu útil

Poder separtador

De la teoría de la difracción sobre la formación d'imáxenes per aciu d'un microscopiu llógrase que la distancia mínima ente dos puntos visibles per separtao ye:

\delta ={\frac {\lambda }{2*A_{N}}}

Onde λ ye'l llonxitú d'onda de la lluz monocromática na que se repara l'oxetu y A ye l'apertura del microscopiu.

Oxetivos d'inmersión

El mediu ópticu líquidu que rellena l'espaciu ente l'oxetu y l'oxetivu denómase líquidu d'inmersión. El índiz de refraición d'esti ye próximu al del vidriu (utilízase agua, glicerina, aceites de cedru y d'enebru, monobromonaftalina, ente otros).^[1]

Anque tolos componentes que constitúin un microscopiu son importantes, los oxetivos son de muncha importancia, yá que la imaxe, a última hora, depende en gran midida de la so calidá. Los meyores oxetivos son aquellos que tán correxíos pa les aberraciones.

Les aberraciones

Son alteraciones óptiques na formación de la imaxe debíes a les mesmes lentes del oxetivu.

aberraciones xeométriques (efeutu Keystone)^[2]
aberraciones cromátiques

Correición de les aberraciones

Pa evitar les aberraciones xeométriques constrúyense los llamaos oxetivos planos o planáticos, lo cual suel tar indicáu nel mesmu oxetivu cola inscripción PLAN. Los oxetivos que tán correxíos pa les aberraciones cromátiques denómense acromáticos (correxíos pal colloráu y l'azul), semiapocromáticos (correxíos pal colloráu y l'azul y tienen una mayor apertura numbérica) y finalmente los apocromáticos (que son de mayor calidá y tán correxíos pal colloráu, l'azul y el verde).

Aplicaciones del microscopiu ópticu

Esti preséu foi de gran utilidá, sobremanera nos campos de la ciencia onde la estructura y l'organización microscópica ye importante, incorporándose con ésitu a investigaciones dientro del área de la química (nel estudiu de cristales), la física (na investigación de les propiedaes físiques de los materiales), la xeoloxía (nel analís de la composición mineralóxica y testural de les roques) y, poques gracies, nel campu de la bioloxía (nel estudiu d'estructures microscópiques de la materia vivo), por citar delles disciplines de la ciencia.

Hasta agora dase usu nel llaboratoriu de histoloxía y anatomía patolóxica, au la microscopía dexa determinaes aplicaciones diagnóstiques, ente elles el diagnósticu de certidume del cáncer, numberoses estructures cristalines, pigmentos, lípidos, proteínes, depósitos óseos, depósitos d'amiloide, etcétera.

Microscopiu estereoscópicu

El diseñu d'esti preséu, tamién denomáu «lente binocular», ye distintu al de la diagrama de más enriba y la so utilidá ye distinta, pos úsase pa ufiertar una imaxe estereoscópica (3D) de la muestra. Pa ello, y como asocede na visión binocular convencional, ye necesario que los dos güeyos reparen la imaxe con ángulos llixeramente distintos. Obviamente tolos microscopios estereoscópicos, por definición, tienen de ser binoculares (con un ocular pa cada güeyu), polo que dacuando tracamúndiense dambos términos. Esisten dos tipos de diseñu, denominaos respeutivamente converxente (o Greenough) y d'oxetivu común (o Galileo).

El diseñu converxente consiste n'usar dos microscopios idénticos atenllaos un ciertu ángulu unu con al respective d'otru y acoplaos mecánicamente de tala forma que enfoquen la imaxe nel mesmu puntu y col mesmu aumentu. Anque ye un diseñu económicu, potente y nel que les aberraciones resulten bien cencielles de correxir, presenta delles llimitaciones tocantes a modularidá (capacidá de modificar el sistema pa poner accesorios) y la observación mientres tiempos llargos resulta fatigosa.

El diseñu d'oxetivu común usa dos rutes óptiques paraleles (una pa cada güeyu) que se faen converxer nel mesmu puntu y con un ciertu ángulu con un oxetivu común a dambos microscopios. El diseñu ye más sofisticáu que'l converxente, con meyor modularidá y nun xenera fatiga en tiempos d'observación llargos. Sicasí ye más costosu de fabricar y les aberraciones, al xenerase la imaxe al traviés de la periferia del oxetivu común y nun ángulu que nun coincide cola exa óptica del mesmu, son más difíciles de correxir.

Los microscopios estereoscópicos suelen tar dotaos, en cualesquier de les sos variantes, d'un sistema pancráticu (zoom) o un sistema de cambiador d'aumentos que dexa reparar la muestra nun rangu d'aumentos variable, siempres menor que'l d'un microscopiu compuestu. El microscopiu estereoscópicu ye afayadizu pa reparar oxetos de tamaños relativamente grandes, polo que nun ye necesariu modificar los oxetos a ver, (llaminar) nin tampoco lo ye que la lluz pase al traviés de la muestra. Esti tipu de microscopios permite unes distancies que van dende un par de centímetros a les decenes d'ellos dende la muestra al oxetivu, lo que lo fai bien útil en botánica, mineraloxía y na industria (microelectrónica, por casu) como en medicina (microscopios quirúrxicos) ya investigación, fundamentalmente n'aplicaciones que riquen manipoliar l'oxetu visualizáu (onde la visión estereoscópica ye esencial).

Podríamos dicir qu'un microscopiu estereoscópicu sirve pa les diseiciones d'animales.

Coneutar una cámara dixital a un microscopiu ópticu

Un adautador ópticu mecánicu ye importante en fotografía dixital. Dichu adautador sirve d'enllaz ente la cámara y el microscopiu. Ye especialmente importante que la conexón mecánica sía firme, pos cualquier movimientu mínimu, esto ye, vibraciones de la cámara, amenorgaría la calidá de la imaxe notablemente. Adicionalmente, ríquese un adautador ópticu pal trayeutu de lluz col que se va llograr asina que'l sensor CCD/CMOS de la cámara proyeute una imaxe de total nitidez y llume.

La fotomicrografía (fotografía fecha cola ayuda d'un microscopiu compuestu) ye un campu bien especializáu de la fotografía, pa la qu'hai disponibles equipos de preciu bien eleváu, y non simples equipos d'estudiu.

Con un microscopiu calidable afayadiza, como los que s'atopen na mayoría de los llaboratorios científicos, pueden facese fotomicrografíes d'una calidá razonable, utilizando una cámara d'usu xeneral, d'oxetivu fixu o intercambiable.

Métodos básicos

Hai dos métodos básicos de tomar fotografíes per mediu del microscopiu. Nel primer métodu l'oxetivu de la cámara fai una función asemeyada a la del cristalín del güeyu y proyeuta sobre'l sensor una imaxe real de la imaxe virtual que se ve pol ocular del microscopiu. Esti métodu ye l'únicu fayadizu pa usu de cámares con oxetivu fixu, esto ye, non intercambiable.

El segundu métodu, afechu pa cámares con oxetivu intercambiable, implica retirar l'oxetivu de la cámara y afaer el microscopiu de cuenta que l'ocular forme una imaxe direutamente sobre'l sensor.

La calidá de la óptica d'un microscopiu (oxetivu y ocular) ye fundamental na determinación de la calidá d'una imaxe fotográfica. Los oxetivos y oculares de microscopiu atópense en distintes calidaes, determinaes pola precisión con que fueron correxíos d'aberraciones. Los oxetivos más económicos tán correxíos d'aberración esférica pa un solu color, xeneralmente'l mariellu verdoso, pero non d'aberración cromática pa la totalidá del espectru visible, sinón solo pa dos o trés colores, primarios. Estos oxetivos llámense acromáticos, y tamién amuesen cierta cantidá de combadura de campu; esto ye, que la totalidá del campu de visión del oxetivu nun puede llevase simultáneamente a focu finu.

Esisten los acromáticos de campu plano, nos que la combadura de campu foi casi totalmente correxida, denómense planacromáticos.

Los apocromáticos tán correxíos d'aberración esférica pa dos colores y d'aberración cromática pa los trés colores primarios. Aínda asina, van amosar combadura de campu nun siendo que sían planapocromáticos, los meyores oxetivos de que se dispón. Los oculares tamién tienen distintes calidaes. Los más simples son los de campu anchu.

Los oculares compensadores diseñar pa compensar ciertes aberraciones cromátiques residuales del oxetivu, y dan el so meyor resultáu cuando s'utilicen con oxetivos apocromáticos, magar que tamién pueden usase con ésitu colos acromáticos de mayor potencia. Esisten los oculares foto, especiales pa fotomicrografía, y cuando s'usencolos oxetivos planapocromáticos dan la meyor calidá posible de fotografía.