Protein çözümleme veya protein assay, bir solüsyondaki çözünmüş formdaki bir proteinin konsantrasyonunu ölçmek için kullanılan analitik spektroskopik bir yöntemdir. Öznel bir yöntemdir, yani örneğin ölçülen bir proteindeki amino asidin bileşimine bağımlıdır. Bu yöntem Marion M. Bradford tarafından bulunduğundan Bradford protein çözümlemesi olarak da bilinir.
Proteinin asidik bir boyanın protein solüsyonuna eklenmesi ve 595 nmde bir spektrofotometre ya da mikroplate okuyucu ile okunması ilkelerine dayanır. Coomassie Brilliant Blue G-250, boyası, 465 nm ila 595 nm'de proteinin bağlanmasıyla tepki verir.
İlke
Test tubes containing Bradford reagent alone (left) and with lysozyme added (right)
Protein çözümlemesi, asidik koşullarda kırmızı, bağlandığı proteinin bazik olması koşullarında ise maviye dönen Coomassie Brilliant Blue G-250 boyasının
renge duyarlı (kolorimetrik) olarak yapıldığı bir yöntemdir.
Bu bileşimin oluşumunda, iki çeşit bağ yer alır: ilkinde Coomassie boyası serbest elektronlarını proteinin iyon gruplarına verir, bu olay proteinin olağan durumunun bozulmasına yol açar ve bu sebeple proteinin hidrofobik bölgeleri açığa çıkar. Proteinin dördüncül yapısındaki bu bölgeler, boyanın kutupsuz bölgelerini van der Waals kuvvetiyle kovalent-olmayan şekilde bağlar ve boyanın negatif yükü yakınındaki pozitif amin gruplarını yeniden konumlandırır. Bu bağ ikinci iyonik etkileşimle daha da güçlendirilir. Proteinin bağlanması Coomassie boyasının mavi formunu sabitler, bu nedenle var olan solüsyonundaki bileşenin miktarı protein yoğunluğunun ölçülmesi için bir orandır ve emilim okunmasıyla saptanabilir.
Boyanın bağlanmış hali en fazla 595 nmde tutulmuştur. Katyonik (bağlanmamış) şekilleri yeşil veya kırmızı olarak görünür. Boyanın proteine bağlanması mavi anyonik formu sabitler. 595 nm emiliminin artışı boyanın miktarıyla orantılıdır ve bu yüzden de örnekteki var olan protein miktarıyla ilişkilidir.
Dezavantajları
Protein çözümlemesi, doğrusal, kısa menzilli bir yöntemdir ve tipik olarak 0 µg/mL ila 2000 µg/mL şeklinde, sıklıkla analizden önce örneklerin dilüsyonu gerektirir. Ayrıca deterjanlar tarafından engellenir.
Doğrusal olmamanın nedeni, proteinin eklenmesiyle karışan boyanın iki formu arasındaki karasızlıktan kaynaklanır.
Bradford protein çözümlemesi, 595 den 450 nm'a kadar olan emilimlerin ölçülmesini doğrusallaştırır. Bu geliştirilmiş assay, geleneksel olandan yaklaşık olarak 10 kez daha duyarlıdır. (Zor & Selinger, 1995)
Bradford, M.M. (1976), "Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal. Biochem., cilt 72, ss. 248-254, doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3, PMID942051
Zor, T.; Selinger, Z. (1996), "Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies", Anal. Biochem., cilt 236, ss. 302-308, doi:10.1006/abio.1996.0171, PMID8660509
