CAM fotosenteziyle birlikte C4 fiksasyonun, bitkilerin çoğunda görülen ve daha basit olan C3 mekanizmasından farklı olduğu anlaşılmıştır. Her iki mekanizmada (Kalvin döngüsünde oluşan ilk enzim) olan RuBisCO'nun fotorespirasyonu veya karbon bileşiklerinden CO2'in oksijen kullanılarak kırılması oluşan enerjiyi harcamak içindir.
Yine de C4 fiksasyonu ATP formundaki enerji girişine C3'ten daha çok ihtiyaç duyar. C4 bitkilerinde, rubisco mezofil hücrelerinde karbonu bağlayarak, oksaloasetatı ve malatı kullanarak atmosferik oksijenden ayırılır, bağlanmış karbonu rubiscoya taşınır ve Kalvin döngüsü enzimleri demet kını hücrelerinde izole edilir. Orta seviyeli bileşiklerin her ikisi de 4 karbon atomu içerir, bu yüzden de C4 olarak isimlendirilirler.
İşleyiş
C4 mekanizmasının işleyişi iki Avustralyalı araştırmacı M. D. Hatch ve C. R. Slack tarafından 1966'da bulunmuştur, mekanizma bu yüzden bazen Hatch-Slack yolu olarak adlandırılır.
C3 bitkilerinde fotosentezin karanlık devre reaksiyonları sırasında ilk adım olarak RuBisCo enzimiyle 3-fosfogliserat içinde CO2 fiksasyonu yapılır. RuBisCo'nun karboksilaz / oksigenaz aktivitesiyle substrat miktarı enerji yok olması ve substrat ziyanıyla sonuçlanan ve fotorespirasyon olarak bilinen yola, karboksillenme oksitlenmeye tercih edilir. Fotorespirasyonu atlayan yolla C4 bitkileri CO2'i RuBisCo enzimine etkileyici şekilde dağıtma yolunu geliştirmişlerdir.
C4 bitkilerinde iki fotosentez yolu birlikte çallıştığı için bu bitkilerin fotosentez kapasitesi fazladır. Oldukça düşük CO2 yoğunluklarında ve stomaların kapalı olduğu durumlarda bile iyi fotosentez yapabilirler. C4 bitkilerinde CO2'i yakalayan iki enzim bulunur. Metabolik yolunda;
I. döngü: mezofil hücreleri ve kloroplastlarda,
II. döngü: aynı yaprağın demet kını hücrelerinin kloroplastlarında gerçekleşir.
C4 bitkilerinde çok yüksek aktiviteye sahip olarak bulunan PEP karboksilaz enzimi CO2'e çok duyarlıdır. Bu enzim substat olarak bikarbonat kullanır. PEP-karboksilazın bikarbonatla ilgisi RuBisCo enziminin CO2'e olan ilgisinden çok fazladır. Bu yüzden bu enzim düşük CO2 konsantrasyonlarında bile yüksek reaksiyon yapar. İşte bu yüzden C4 bitkilerinde çok düşük CO2 derişimlerinde bile fotosentez hızı yüksektir.