Сын дьякона. Окончил Самарское духовное училище и Самарскую духовную семинарию. В 1898 поступил на историко-филологический факультет Юрьевского университета (где начал заниматься творчеством А. С. Грибоедова), одновременно изучал историю русского права на юридическом факультете. Участвовал в студенческом революционном движении; был осуждён и после 5-месячного заключения выслан в Самару. В 1903 году был восстановлен в Юрьевском университете, который окончил в декабре 1904 года[4].
В 1932 году назначен профессором Ленинградского университета, заведовал кафедрой русской литературы (1932—1937). Затем — профессор Саратовского университета (1942—1944), профессор МГУ (1944—1948). В 1948 году вернулся в Ленинградский университет.
Начал свою научную деятельность как историк общественного движения и русской литературы XIX века. Предприняв поиски в архивах, библиотеках и частных рукописных собраниях, обнаружил около шестидесяти рукописных списков комедии А. С. Грибоедова «Горе от ума». Они позволили ему реконструировать текст комедии, который и сегодня издаётся в этой редакции.
Опубликовал около восьмисот работ по истории русской литературы и общественной мысли, а также по источниковедению, текстологии и методологии литературоведения, методологии краеведения. Писал о творчестве А. С. Грибоедова, А. С. Пушкина, И. С. Тургенева, И. А. Гончарова. В 1911—1913 годах выпустил трёхтомное академическое собрание сочинений А. С. Грибоедова.
В 1916—1917 годах подготовил и издал в Петрограде под своей редакцией исторические очерки академика А. Н. Пыпина «Русское масонство. XVIII и первая четверть XIX в.», «Религиозные движения при Александре I» и «Очерки литературы и общественности при Александре I». В 1947 году опубликовал очерк «Масонская литература», появившийся в четвёртом томе «История русской литературы» (М.-Л.: АН СССР, 1947) — наиболее полный монографический очерк, посвящённый масонской литературе XVIII и первой четверти XIX века.
Будучи известным учёным и собирателем книг, обладал огромной библиотекой, насчитывавшей более пятнадцати тысяч книг, журналов, справочников, журнальных статей, которые были распределены по разделам. Каждый раздел содержал собственные рукописные выписки учёного из различных источников. По завещанию Пиксанова его библиотека перевезена в Институт русской литературы (Пушкинский дом) и помещена в башне, где находится и сегодня.
Грибоедов и Мольер (переоценка традиции). — М.: Гос. изд-во, 1922. — 80 с.
Пушкинская студия: Введение в изучение Пушкина. Темы для литературных работ. Систематическая библиография. Руководящие вопросы. — Петроград: Атеней, 1922. - 98 с.
Новый путь литературной науки. — М.: Гознак, 1923.
Старорусская повесть: Введение в историю повести. Темы для литературных работ. Систематическая библиография. Руководящие вопросы : [пособие для высшей школы, преподавателей словесности и самообразования]. — М.; Пг.: Госиздат, 1923. — 92, [IV] с.
Два века русской литературы. — 2-е изд. — М., 1924.
Грибоедов и старое барство: по неизданным материалам составил Н. К. Пиксанов. — М.: Никитинские субботники, 1926. — 76, [1] с.: ил., портр.
Творческая история «Горя от ума». — М., 1928
Дворянская реакция на декабризм // Звенья: Сборники материалов и документов по истории литературы, искусства и общественной мысли XIX века / Под редакцией В. Д. Бонч-Бруевича и А. В. Луначарского: Т. II. — М.-Л.: Academia, 1933.
О классиках. — М., 1933
Грибоедов. Исследования и характеристики. — Л.: Изд. писателей, 1934. — 333 с.
Горький — поэт. — Л., 1940
Ленинград — любовь и гордость советского народа. — Ташкент, 1942.
М. Горький и национальные литературы. — М., 1946.
М. Горький и музыка. — М.-Л., 1950.
Крестьянское восстание в «Вадиме» Лермонтова. — Саратов, 1967.
Роман Гончарова «Обрыв» в свете социальной истории. — Л.: Наука, 1968.
Лебедев С. Б. Библиотека Пиксанова // Смена. — 16 февраля 1973;
Лебедев С. Б. Уникальная научная лаборатория // Смена. — 20 мая 1973;
Лебедев С. Б. Эпизод из студенческой жизни Н. К. Пиксанова. (Письмо М. А. Дьяконова А. Н. Пыпину) // Русская литература. — 1978. — № 2. — С. 203—205;
Тишкин Г. А. Пиксанов — преподаватель Бестужевских курсов // Русская литература. — 1978. — № 4;
Живые традиции: Из истории и теории литературы [Сборник статей. К 100-летию со дня рождения Н. К. Пиксанова]. — Саратов, 1978;
Соколов Н. И. Н. К. Пиксанов как историк русской литературы // От Грибоедова до Горького: из истории русской литературы. — Л., 1979;
Борисов Ю. Н. Николай Кирьякович Пиксанов // Методика и методология изучения русской литературы и фольклора: Учёные-педагоги Саратовской филологической школы. / Под ред. Е. П. Никитиной. — Саратов: Изд-во Саратовского университета, 1984. — С. 35-53;
Шечкова С. А. Н. К. Пиксанов — исследователь жизни и творчества А. С. Грибоедов: методологический аспект. Автореф. дис.… канд. филол. наук. — Харьков, 1991;