Coomassie Brilliant Blue (кумасси бриллиантовый синий) — название двух близких трифенилметановых красителей, разработанных для текстильной индустрии, но в настоящее время широко используемых в аналитической биохимии для окраски белков. Coomassie Brilliant Blue G-250 отличается от R-250 наличием двух метильных групп. Название «Coomassie» — зарегистрированный товарный знакImperial Chemical Industries.
Название Кумасси было зарегистрировано в конце 19 века в качестве торговой марки компанией Blackley, для красителей шерсти.[1] В 1896 году в ходе Четвертой Англо-ашантийской войны, войска Великобритании заняли город Coomassie (в настоящее время Кумаси в Гане). В 1918 году компания Levinstein Ltd, владелец торговой марки Кумасси, стала частью компании British Dyestuffs, которая в 1926 году была поглощена компанией Imperial Chemical Industries.[2] В настоящее время компания Imperial Chemical Industries не производит красителей, но остается владельцем торговой марки Coomassie .
Синие красители на основе сернистных производных трифенилметана были впервые получены в 1913 году Максом Вейлером, который работал в городе Вупперталь (Германия).[3][4][5][6]
Статьи в биохимических журналах часто не расшифровывают, какой именно краситель «Coomassie» был использован. Перечень цветов en:Colour Index International содержит более 40 красителей, содержащих термин «Coomassie» в названии. Синий краситель кумасси из перечня Merck Index (10th edition) — Coomassie Blue RL (Acid Blue 92, C.I. 13390) имеет совершенно иную структуру.
Цвет красителя
Раствор бриллиантового синего кумасси G в изопропаноле
Суффикс «R» в названии красителя Coomassie Brilliant Blue R-250 является аббревиатурой от слова Red (красный), так как синий цвет красителя имеет слабый красноватый оттенок. Вариант красителя с суффиксом «G» имеет слабый зеленоватый оттенок. Цифры «250» обозначали чистоту красителя.
Цвет красителей зависит от кислотности среды. Краситель «G» подробно изучен.[7] При pH ниже 0 краситель имеет красную окраску и максимум поглощения на длине 470 нм. При pH около 1 краситель зеленый и максимум поглощения составляет 620 нм. При рН выше 2 краситель ярко-синий, максимум поглощения на 595. При pH 7 краситель имеет коэффициент молярной экстинкции 43,000 M−1см−1.[7]
Изменение окраски раствора соответствует изменению заряда молекулы красителя. В красной форме три атома азота заряжены положительно. Два остатка серной кислоты имеют очень низкий pKa и потому обычно заряжены отрицательно, поэтому при pH близких к нулю, краситель представляет собой катион с суммарным зарядом +1. Зеленый цвет соответствует незаряженной молекуле. При pH 7 лишь атом азота в составе дифениламина имеет положительный заряд, поэтому молекула в целом является анионом с суммарным зарядом −1. Значения pKa, необходимые для потери двух протонов составляют 1,15 и 1,82. Последний протон отрывается в щелочной среде, при этом молекула приобретает розовую окраску (pKa 12,4).[7]
Красители образуют комплекс с анионными детергентами, например, с лаурилсульфатом натрия.[8] Образование такого комплекса стабилизирует зеленый цвет нейтральной формы красителя. Этот эффект может оказывать влияние на определение концентрации при помощи метода Бредфорда. Вероятно, анионные детергенты конкурируют с красителем за связывание с белком.
Использование в биохимии
Раствор бриллиантового синего кумасси (справа) подготовленный для вестерн-блоттинга
Coomassie Brilliant Blue R-250 был использован для окрашивания белков в 1964 году[9]. Образцы белков были разделены электрофорезом на листе ацетата целлюлозы. Лист помещали в сульфосалициловую кислоту для фиксации белков и затем переносили в раствор красителя.
В 1965 году Coomassie Brilliant Blue R-250 был использован для окрашивания белков после электрофоретического разделения в полиакриламидном геле[10]. Гель помещали в раствор красителя, содержащий метанол, уксусную кислоту и воду. После окрашивания белков полиакриамидный гель (ПААГ) должен был быть отмыт электрофоретически. Далее было показано, что гель может быть отмыт раствором уксусной кислоты.
Краситель «G» был впервые использован для визуализации белков в полиакриламидном геле в 1967 году, при этом краситель растворяли в растворе уксусной кислоты с метанолом[11].
Позднее было показано, что белковые полосы могут быть окрашены без коллоидного красителя «G», в растворе трихлоруксусной кислоты без метанола. Использование этого протокола не требует отмывания геля[12].
Современные протоколы используют коллоидную форму красителя «G» в растворе, содержащем фосфорную кислоту, этанол (или метанол) и сульфат аммония[13][14][15][16].
Метод Бредфорда использует спектральные свойства Coomassie Brilliant Blue G-250 для определения количества белка в растворе[17]. Для этого к образцу белка добавляют раствор красителя в фосфорной кислоте и этаноле. В кислых условиях краска имеет коричневый цвет, но при связывании с белком становится синей. Оптическое поглощение раствора измеряют на длине волны 595 нм.
Связывание белка с отрицательно заряженным Coomassie Brilliant Blue G-250 придаёт белку отрицательный заряд, что может быть использовано при разделении смесей белков в ПААГ в неденатурирующих условиях при помощи метода Blue Native PAGE[18][19].
Подвижность комплекса в полиакриламидном геле зависит от размера белка, белкового комплекса, а также количества красителя, связываемого белком.
↑Fox, M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes (англ.). — Manchester: Imperial Chemical Industries, 1987. — P. 38.
↑Fox, M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes (англ.). — Manchester: Imperial Chemical Industries, 1987. — P. 259.
↑Colour Index (неопр.). — 3rd. — Bradford: Society of Dyers and Colourists, 1971. — Т. 4. — С. 4397—4398. Архивировано 19 июля 2011 года.Архивированная копия (неопр.). Дата обращения: 27 мая 2013. Архивировано 19 июля 2011 года.
↑, "Procédé de production de colorants de la série du triarylméthane", FR patent 474260, issued 1915-02-16
↑Weiler, Max, "Blue Triphenylmethane Dye", US patent 1218232, issued 1917-03-06
↑, "Manufacture of Triarylmethane-dyestuffs", GB patent 275609, issued 1927-11-03
↑Meyer, T. S.; Lambert, B. L. Use of Coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips (англ.) // Biochimica et Biophysica Acta[англ.] : journal. — 1965. — Vol. 107, no. 1. — P. 144—145. — doi:10.1016/0304-4165(65)90403-4. — PMID4159310.
↑Altschul, A. M.; Evans, W. J. Zone electrophoresis with polyacrylamide gel (англ.) // Methods in Enzymology : journal. — 1967. — Vol. 11. — P. 179—186. — doi:10.1016/S0076-6879(67)11019-7.. Page 184 personal communication from W. J. Saphonov.
↑Diezel, W.; Kopperschläger, G.; Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue (англ.) // Analytical Biochemistry[англ.] : journal. — 1972. — Vol. 48, no. 2. — P. 617—620. — doi:10.1016/0003-2697(72)90117-0. — PMID4115985.
↑Neuhoff, V.; Stamm, R.; Eibl, H. Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: a systematic analysis (англ.) // Electrophoresis : journal. — 1985. — Vol. 6, no. 9. — P. 427—448. — doi:10.1002/elps.1150060905.
↑Candiano, G.; Bruschi, M.; Musante, L.; Santucci, L.; Ghiggeri, G. M.; Carnemolla, B.; Orecchia, P.; Zardi, L.; Righetti, P. G. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis (англ.) // Electrophoresis : journal. — 2004. — Vol. 25, no. 9. — P. 1327—1333. — doi:10.1002/elps.200305844. — PMID15174055.
