Han trakk seg fra sin stilling som forlegger i november 2003. Han var av siciliansk avstamning og ble oppdratt som katolikk i Bergenfield i New Jersey. Hans far var en regnskapsfører. Han vurderte, men forkastet senere ideen om å gå inn i prestedømmet.
Guccione giftet seg med den første av hans tre koner, Lilyann Becker, før han fylte 20 år, og de hadde en datter, Tonia, sammen. Ekteskapet mislyktes snart. Han forlot sin kone og barn for å reise til Europa, hvor han ønsket å bli maler. Der møtte han til slutt en britisk kvinne, Muriel, og han flyttet til London sammen med henne, der de giftet seg. De hadde to barn, Bob Junior og Tony.
Bladet Penthouse ble publisert for første gang i 1965 i England og i Nord-Amerika fra 1969. Magasinet var et forsøk på å konkurrere med Hugh Hefner og hans pornoblad Playboy. På grunn av deres mangel på penger og andre ressurser, sto Guccione selv for fotograferingen av de fleste av modellene for magasinets tidligste utgaver. På grunn av manglende profesjonell trening, anvendte Guccione sin kunnskap angående maleri til fotografiene hans. Guccione brukte noen ganger flere dager på å fullføre et enkelt fotografi.
Ettersom bladet vokste seg mer vellykket, fikk Guccione muligheten for et liv i luksus, hans tidligere herskapshuset sies å være den største private residens på Manhattan på ca 22 000 kvadratmeter. I 1976 brukte Guccione rundt 17 500 000 amerikanske dollar av sin personlige formue til å finansiere den omstridte historiske episke filmen, Caligula som var en hardcore porno flick, og hadde Malcolm McDowell i hovedrollen og biroller av Helen Mirren, John Gielgud og Peter O’Toole.
Han giftet seg med sin mangeårige kompanjong, Kathy Keeton, opprinnelig fra Sør-Afrika. Hun døde i 1997, 58 år gammel, etter behandling for langt fremskredet kreft. Guccione led av kreft selv. Han ble diagnostisert med strupekreft og døde i 2010 i en alder av 80 år.