Applegate werd geboren in Hollywood, Californië. Haar vader was platenproducent, haar moeder zangeres en actrice.
Applegate stopte op haar zeventiende met school om te gaan acteren. Van 1987 tot 1997 speelde ze in de serie Married... with Children. Van 1998 tot 2000 had ze haar eigen serie genaamd Jesse. In 2002 speelde ze samen met Cameron Diaz in de film The Sweetest Thing.
Applegate was op 31 oktober 1993 te gast in de nachtclub The Viper Room, destijds gedeeltelijk eigendom van Johnny Depp. Toen ze na het bezoek aan de nachtclub weer buitenkwam, trof ze een door overmatig drugsgebruik ziek geworden en inmiddels ingestorte River Phoenix aan, die kort daarvoor door zijn broer, zijn zus en zijn vriendin al uit de nachtclub begeleid was. Enige uren hierna stierf Phoenix.
In 2001 trouwde Applegate met acteur Johnathon Schaech, tijdens een kleine ceremonie in Palm Springs, in aanwezigheid van vrienden en familie. In 2005 vroeg Schaech hun echtscheiding aan. Sinds 2008 heeft ze een relatie met de Nederlandse basgitarist Martijn LeNoble. Ze verloofden zich op Valentijnsdag 2010. In januari 2011 werd hun dochter geboren. Applegate en LeNoble trouwden op 23 februari 2013. Voor beiden is het hun tweede huwelijk.[3][4]
In 2003 was Applegate de spreker van Lee National Denim Day, dat miljoenen dollars ophaalde voor borstkankeronderzoek. In 2008 moest Applegate worden behandeld voor borstkanker in een vroeg stadium.[5] Ze heeft beide borsten moeten laten amputeren.[6] Op 19 augustus, amper een maand na haar diagnose, was Applegate volledig kankervrij.[7] In augustus 2021 kondigde Applegate aan dat ze enkele maanden daarvoor was gediagnosticeerd met multiple sclerose.[8] De ziekte beïnvloedde haar vermogen om op de set te presteren tijdens het laatste seizoen van Dead to Me aanzienlijk.[9]
