1536년 감역이 되었다가 얼마 되지 않아 6품으로 승진, 갑작스러운 승진으로 대간의 논박을 받고 체직되었다. 1537년 좌사어로 근무할 때 사돈인 희락당 김안로(金安老)와 다투다가 파직, 여러번 대간의 논박을 받고 문외출송되었다가 유배되었다. 그 뒤 김안로가 문정왕후를 폐출하려다가 실패하자 관직에 복귀했다. 44년 윤임과 다투다가 파직·유배되었다.
중종이 죽고 1544년(인종 1년) 인종이 즉위해 윤임의 대윤이 득세하자 탄핵을 받고 파직당했다.[2] 이후 그는 동생인 윤원형, 조카 윤춘년 등과 짜고 윤임을 축출할 계획을 세운다. 그해 군기시 첨정이 되었다.
1545년(명종 즉위년) 인종이 죽고 명종이 즉위하자 다시 풀려나 군기감첨정이 되었다. 국왕의 장례는 5월장이 원칙이었으나 문정왕후·윤원형·이기(李芑) 등과 함께 '인종은 1년을 넘기지 못한 임금이니 대왕의 예를 쓰는 것은 옳지 않다'고 하면서 인종의 장례를 박하게 치르게 했다.[2]
그해 7월 앞서 다시 윤임 등 대윤(大尹) 일파를 축출하려고 대윤 일파가 경원대군을 해치려 했다고 무고(誣告)했으나, 영의정 윤인경(尹仁鏡)과 좌의정 유관(柳灌)이 망언(妄言)을 조작하고 천친(天親)을 이간한다고 탄핵함으로써 전라남도해남으로 유배되었다가 1년 만에 풀려났다. 대윤의 윤임은 그와 9촌 숙질간이 된다.
그 뒤 을사사화로 윤임, 유관(柳灌), 유인숙 일파가 제거, 사사되자 석방됐다. 그 뒤 군기시 첨정(軍器寺僉正), 돈녕부도정에 이르렀으나 공신에 참여하지 못한 것을 분하게 여기다가 1546년 동생 윤원형과의 정쟁에서 패하여 탄핵을 받아 파직 유배되고, 배소에서 사사당하였다. 바로 상구와 관곽이 내려졌으나 사헌부 등이 이를 문제삼기도 했다. 이 일로 그의 아들 윤백원은 윤원형의 정적인 이량과 결탁하게 되었다.
정적인 김안로(金安老)와 사돈관계를 형성하기도 했다. 김안로의 사촌 형 김안수의 딸이 동생 윤원형의 본부인이다. 윤원로의 아들 윤백원은 중종의 딸 효혜공주와 연성위 김희(延城尉 金禧 ? ~ 1531년)의 딸 김선옥(金善玉, 1531년 ~ ?)과 결혼했다. 며느리 김선옥은 김안로의 손녀였다.