Mamoulian nacque a Tbilisi, in Georgia (all'epoca una provincia della Russia zarista), l'8 ottobre del 1897 da un'agiata famiglia armena. Si trasferì in Inghilterra nel 1922, iniziando la sua attività di regista di commedie teatrali a Londra. Successivamente passò negli Stati Uniti, dove iniziò lavorando come regista teatrale e di opere liriche.
Regista teatrale
A Broadway diede il via alla sua carriera di regista con una produzione di Porgy di DuBose Heyward, che mise in scena la sua prima rappresentazione il 10 ottobre 1927, per poi dirigere il remake dell'opera (in parte mutato dopo l'intervento di George Gershwin), dal titolo Porgy and Bess (10 ottobre 1935).
Il suo primo film, Applause (1929), fu anche uno dei primissimi film parlati dopo l'era del cinema muto; Mamoulian utilizzò la camera in maniera innovativa sia per i movimenti che per il suono e le nuove tecniche di ripresa furono utilizzate anche in uno dei suoi film più celebri, Il dottor Jekyll (1931), e nel musical Amami stanotte (1932).
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