La raccolta museale inizia con alcuni ambienti del castello quali la cappella Palatina e la sala dell'Armeria, per poi arrivare ai primi due piani nei quali sono esposti sculture, oggetti e dipinti dall'epoca medievale al tardo ottocento.
Di particolare importanza sono le pregevoli sculture effettuate da artisti che lavorarono anche all'arco trionfale di Alfonso V d'Aragona (XV secolo), esempi del rinascimento napoletano. Tra queste due Madonna in trono col Bambino di Francesco Laurana, una delle quali detta anche Madonna del Passero, proveniente da Sant'Agostino alla Zecca. Quest'opera fu fatta durante il primo soggiorno napoletano dell'artista e si avvicina di più, nello stile, all'arco alfonsino fatto dallo stesso Laurana. L'altra opera del Laurana, invece, fu scolpita durante il secondo soggiorno napoletano avvenuto nel 1474 e la scultura fu fatta proprio per la cappella Palatina.
Altre opere di primissimo ordine sono quelle di Domenico Gagini, allievo di Donatello e Brunelleschi, che di fronte uno all'altro, eseguì due Tabernacoli con la Madonna e il Bambino posizionati sulle pareti laterali ed una Madonna col Bambino proveniente dall'Annunziata Maggiore.
L'interno della cappella presentava affreschi di Giotto, eseguiti verso il 1330, che riprendevano le Storie del Vecchio e Nuovo Testamento. Il contenuto di questo ciclo d'affreschi è quasi interamente perduto anche se ve ne rimangono parti decorative negli sguanci delle finestre che ricordano quelli della cappella Bardi in Santa Croce a Firenze. Sono infine esposti oggetti in argento che costituivano gran parte delle suppellettili della basilica della Santissima Annunziata Maggiore, tra cui spiccano candelieri di epoca barocca.
Storie di san Guglielmo di Gellone (diversi frammenti del ciclo di affreschi provenienti dal castello del Balzo)
San Pietro Celestino (papa Celestine V) (affresco dal castello del Balzo)
Raimondo del Balzo presentato da san Guglielmo di Gellone (affresco dal castello del Balzo)
Sala dell'Armeria
Entrati nella sala, si nota subito una vasca di villa suburbana, del V secolo, rivestita da lastre di marmo bianco su cui si inserisce la cortina muraria angioina. La parte più antica di tali reperti, databili I secolo a.C., è localizzata nella parte orientale della sala ed è rappresentata da un'abside che si apre in cinque nicchie semicircolari. L'ipotesi più accreditata, è che si tratti di una piscina appartenente ad una villa dell'epoca, probabilmente quella di Licinio Lucullo.
Sono inoltre state rinvenute diverse decine di sepolture, risalenti al periodo in cui quell'area assunse il ruolo di necropoli (VI-XII secolo), con corredi funerari minimi e con alcuni oggetti personali quali anelli, orecchini ed una coppia di speroni in bronzo decorati da un felino.
Primo livello
Il piano offre la visita di opere di provenienza da chiese cittadine chiuse o da enti soppressi. Le sale sono in ordine cronologico e si trovano, così come quelle del secondo piano, nell'ala sud-ovest del castello.
Madonna con Bambino e san Mauro Abate (1725-30 circa)
Miracolo di san Giovanni di Dio
Secondo livello
Al secondo piano sono conservate opere pittoriche dell'Ottocento e del Novecento oggi di proprietà del Comune di Napoli. Sono inoltre esposte sculture di Vincenzo Gemito ed anche le opere di Francesco Jerace facenti parte della donazione Jerace, avvenuta proprio a favore del Comune.
Il tema delle opere esposte riguarda essenzialmente contenuti patriottici, risorgimentali e di valori rivoluzionari improntati al coraggio e al sacrificio per l'Italia. Si registrano inoltre dipinti del genere paesaggistico della scuola di Posillipo, tra cui opere di Federico Rossano.