Nacque nel maggio 1578 come istituto caritatevole per l'accoglienza di orfani e di bambini abbandonati, i quali venivano avviati fin da piccoli ai futuri impieghi artigianali. Questa fondazione prese il nome di Congregazione delle Vesti Bianche, dato che vestivano tradizionalmente un abito bianco.
Diventò effettivamente una scuola di musica nel 1653, quando risultano menzionati undici allievi, due maestri di canto e un maestro di cappella. I piccoli scolari, dei quali quasi un quinto erano castrati, indossavano come divisa una sottana bianca e una zimarra e un cappello marrone. Durante il Seicento il compito principale del Conservatorio era quello di ammaestrare putti cantori per le processioni e gli oratori. Tra la seconda metà del stesso secolo e i primi anni del Settecento, attraverso il severo operato dei suoi maestri come Cristoforo Caresana, Angelo Durante (zio del celebre Francesco Durante), Nicola Sabini e Nicola Fago, la scuola si sviluppo notevolmente e, grazie all'elevata qualità dell'insegnamento condotto al suo interno, ben presto lo portò a concorrere con gli altri tre istituti. Nella prima metà del Settecento grandi nomi della musica napoletana insegnavano al Sant'Onofrio, tra i quali Francesco Durante, Nicola Porpora, Francesco Feo e Girolamo Abos; nella seconda metà del secolo, invece, si ricordano Carlo Cotumacci, Joseph Doll, Giacomo Insanguine, Giovanni Furno e Salvatore Rispoli.
