Pada tanggal 2 Februari 1622, ia menikah di Innsbruck dengan kaisar Ferdinand II, duda Maria Anna dari Bayern sejak tahun 1616. Beberapa penasihat kaisar menentang pernikahan ini dan wangsa Gonzaga tidak mendapat keuntungan dari ikatan tersebut. Pada tahun 1630, selama Perang Penerus Mantova, pasukan kekaisaran mengambil dan menghancurkan kota Italia.
Eleonora digambarkan sebagai wanita yang cantik dan saleh. Ia mendirikan antara lain biara-biara Karmelit di Graz dan Wina. Pasangan itu tidak memiliki keturunan namun Ferdinand memiliki empat orang anak dari pernikahan pertamanya.
Eleonora meninggal pada tahun 1655. Ia awalnya dimakamkan di biara Karmelit di Wina, kemudian pada tahun 1782, jenazahnya dipindahkan ke katedral kota.
Braun, Bettina; Keller, Katrin; Schnettger, Matthias (4 April 2016). Nur die Frau des Kaisers?: Kaiserinnen in der Frühen Neuzeit (dalam bahasa Jerman). Böhlau Verlag Wien. hlm. 117. ISBN978-3-205-20085-7.
Raviola, Blythe Alice (2014). Corti e diplomazia nell'Europa del Seicento: Correggio e Ottavio Bolognesi (dalam bahasa Italia). Universitas Studiorum. hlm. 24, 43–44, 49, 171. ISBN978-8-89-768364-3.
Semenov, S. (2002). Christian European dynasty (dalam bahasa Rusia). OLMA Media Group. hlm. 198. ISBN978-5-22-402516-9.
* juga seorang infanta Spanyol melalui pernikahan ** juga seorang putri Toskana melalui pernikahan *** juga seorang putri Modena melalui pernikahan ^juga seorang adipati agung Austria dengan haknya sendiri ^^tidak memiliki gelar kerajaan atau bangsawan melalui kelahiran