19 éves korában férjhez ment Olekszandr Timosenkóhoz, a szovjet kommunista párt (SZKP) egy középvezetőjének fiához, majd a Komszomolban töltött be tisztségeket. 1984-ben végzett a Dnyipropetrovszki Állami Egyetemen közgazdászként, később pedig kandidátusi fokozatot szerzett. A peresztrojka által megteremtett környezetben hamar komoly üzleti sikereket ért el, azon belül is főleg az energiaiparban. 1990–1998 között több nagy vállalat vezetője volt. 1995-től két éven át a legnagyobb ukrán földgázimportőr céget vezette, ekkor kapta a „gázhercegnő” becenevet. Meggazdagodásában jelentős szerepet játszott a Pavlo Lazarenko exkormányfőhöz fűződő viszonya. Férjével, Olekszandr Timosenkóval együtt ők szerezték meg az ukrán energia- és nyersanyag-gazdálkodás kulcspozícióit.
A politikában 1996-ban jelent meg, képviselői mandátumot szerezve az ukrán törvényhozásban. A Kirovohradi területen rekordnak számító 92,3%-os támogatottságot ért el. Politikai életútja ezután számos színes fordulatban bontakozott ki miniszterelnökségéig. 1999-től 2001-ig Viktor Juscsenko miniszterelnök-helyettese volt. 2001-ben Leonyid Kucsma elnök, vámokirat hamisítással és földgázcsempészéssel vádolva, lemondatta posztjáról, sőt börtönbe is záratta. Innen néhány hét múlva szabadult; a vádak végül nem bizonyosodtak be.
2005 júliusában a Forbes magazin a világ harmadik legbefolyásosabb nőjének szavazta meg; csak Condoleezza Rice és Wu Yi kerültek elé.
2011. augusztus 5-én letartóztatták azzal a váddal, hogy 2009-ben a kormány jóváhagyása nélkül engedélyezte az orosz gáz magasabb áron történő vásárlásáról szóló szerződések aláírását, amelyek így rendkívüli előnytelenek voltak Kijev számára.[1] Október 11-én hét év börtönre ítélték. Az EU szerint az eljárás mögött politikai megfontolások álltak.
2014. február 22-én szabadon engedték,[2] és pár óra után már Kijevben, a Majdanon tartott beszédet.[3] Március 8-án Berlinben megkezdték akut porckorongproblémái orvoslását, melyek mozgásszervi panaszokat okoztak, emiatt csak kerekesszékkel és bottal volt képes közlekedni.[4] 2014. április 14-én a Legfelsőbb Bíróság bűncselekmény hiányában megszüntette az ellene folytatott eljárást.[5] Elindult a 2014. május 26-án tartott elnökválasztáson is, de kikapott Petro Porosenko üzletembertől, akire a legtöbb szavazat érkezett.[6]
2020. augusztus 23-án koronavírus-fertőzéssel diagnosztizálták. Kórházba szállították. Állapotát súlyosnak, de nem életveszélyesnek minősítették. A láza nem csökkent 39°C alá. Később gépi lélegeztetést alkalmaztak.[7] Timosenko családtagjai között is találtak fertőzötteket: lánya, Jevhenyija, valamint annak férjének a tesztje is pozitív lett.